江浙蝮蛇毒诱导类风湿性关节炎患者滑膜细胞凋亡的实验研究_药学论文.docVIP

江浙蝮蛇毒诱导类风湿性关节炎患者滑膜细胞凋亡的实验研究_药学论文 江浙蝮蛇毒诱导类风湿性关节炎患者滑膜细胞凋亡的实验研究_药学论文 作者：胡珏 杨旭燕 吕庆华 许东航 【关键词】 江浙 蝮蛇毒 类风湿性关节炎 滑膜细胞凋亡 类风湿性关节炎（RA）是一种以滑膜增生、淋巴巨噬细胞浸润滑膜层并伴有少量的凋亡为特征的自身免疫性疾病。既往研究表明抗凋亡蛋白Bcl-2在RA患者中较普通骨关节炎患者显著上调，从而抑制滑液成纤维细胞的凋亡，并导致RA患者滑膜的超常增生［１，２］。 江浙蝮蛇毒（Agkistrodom halys Pallas venom，ASV）的主要活性成分蛇毒蛋白有诱导凋亡和抗肿瘤作用，临床上已被用于治疗类风湿性关节炎等慢性疾病所致的炎症和疼痛［３，４］。然而，ASV对RA患者的治疗作用机制尚未明确。作者自2007年2至7月检测ASV对RA患者滑液成纤维细胞的抑制增殖和诱导凋亡作用。 1 临床资料 1.1 一般资料 选择浙江大学附属第二医院骨科行膝关节置换术的RA患者6例，其中男3例，女3例；年龄34～62岁，平均（50±10）岁；病程6～30年，平均（14±10）年。所有患者皆符合1987年美国风湿病学会（ACR）修订的RA诊断标准。 1.2 主要试剂 DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶、FBS，美国Gibco公司；ASV由浙江龙图蛇业集团有限公司提供，-20℃ 保存；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit，美国BD公司；鼠抗人bcl-2-FITC-mAb、羊-抗鼠-FITC-IgG-mAb，美国Caltag公司；碘化吡啶，美国Sigma公司。 1.3 滑膜细胞的分离和培养 无菌条件下，从关节置换术获得的滑膜组织切成3～5 mm的碎片，用胶原酶Ⅱ和等体积的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2孵箱中消化4 h。常规离心，弃上清液后加0.25 %胰酶1 ml，混匀后消化30 min。1000 r/min离心后弃上清液，加入含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，放至37 ℃、5 %CO2孵箱中孵育，常规传代培养。 1.4 MTT法检测ASV对RA滑膜细胞活力影响 调整细胞悬液浓度为7×104/ml左右，接种于96 孔培养板中，每孔体积100 μl，培养24 h。加入不同质量浓度的ASV（1.25、2.5、5、10 μg/ml），以溶剂为阴性对照，再入培养箱于相同条件下培养。分别培养24、48、72 h后，每孔加入10 μl MTT（5 mg/ml），在培养箱内放置3 h，试验结束时吸去上清液，加入150μl DMSO，震荡10 min，用酶联免疫检测仪于490 nm处测定各孔吸光度（A）值，记录结果，计算抑制率。 1.5 细胞凋亡检测 采用流式细胞仪结合碘化丙啶（PI）和Annexin V-FITC双标记染色测定细胞凋亡率。取对数生长期细胞，细胞浓度为2×105/ml。分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10μg/ml），作用24、48 h后，胰酶消化收集细胞。PBS洗涤细胞2次，用1×Binding Buffer重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC，混匀，室温避光孵育15 min，再加入5 μl的20 μg/ml的PI，混匀后室温避光孵育5 min，在1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。 1.6 细胞周期分析 取对数生长期的细胞，调整细胞浓度至5×105/ml，分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10 μg/ml），作用24 h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，70 %冰乙醇固定，4 ℃保存。上机测定前，离心去乙醇，用PBS洗涤2次。加入500 μl PI （50 μg/ml），4 ℃避光染色30 min，用200 目尼龙网过滤，上机检测。 1.7 Bcl-2蛋白表达分析 取对数生长期的细胞，调整细胞浓度至5×105/ml，分组后加入不同质量浓度的ASV（2.5、5、10 μg/ml），作用24 h后，用含70%乙醇的PBS 1ml渗透细胞30 min，冲洗2 次，弃上清液。加FITC标记的bcl-2单抗（1∶50）100μl，4 ℃下孵育30 min，PBS洗2次。加FITC标记的羊抗鼠IgG（1∶200）100 μl，4 ℃下孵育30 min ，PBS洗2次。用PBS代替单抗作阴性对照，立即进行流式细胞仪检测，bcl-2蛋白表达水平以阳性细胞百分率表示。 1.8 统计学分析 全部实验结果均来自至少3组平行实验，数据用(x±s)表示。组间差异性比较采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，0.05有显著性差异。 2 结果 2.1 ASV对细胞增殖的影响 MTT比色结果显示，不同浓度的AS