HPLC培训讲稿.doc

一、液相色谱理论发展简况 液相色谱实际是一种分离方法，就象以前所用的萃取、蒸馏、离心、过滤等等一样。其分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时采用的实验方法。他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带（Tswett）用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)，色谱法(Chromatography)因之得名。 色谱法自20世纪30年代开始广泛研究，发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法，而高压液相色谱法的广泛应用则到20世纪70年代。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 介绍《超高效液相色谱（UPLC）的应用》 二、HPLC的特点 适用范围宽：现在绝大部分化学类药品皆可采用该仪器分析。 分离效率高：复方分析（提及一下紫外法测定复方成分的应用，如Co.SMZ）、辅料干扰时（提及溶出度含量测定时，尤其是溶出量明显大于含量时）等情况下，更显示其威力。 速度快：在摸索色谱条件时，一般使主成分出峰时间在30min以内（太快可以，详细说明）；但如为有关物质测定，当然是主成分与杂质分离为首要条件。这里需要强调的是，通常采用流速为1.0ml/min，柱温30~40℃的测定条件。这里指的是在新建立一个分析方法时；但当实际应用时，是可以任意改变的。一般含量测定、溶出度可调整为出峰时间快一些，有关物质测定一般调整的慢一些，最好10~15min左右出锋，采用25cm长的色谱柱为好(看柱效)，但出峰时间过长，又会使峰形变得较差，具体问题具体分析。 流速和柱温均可适当改变，以适应测定的需要。如含量测定时，可适当加大流速（流速提高依柱压而定）和提高柱温（60℃以下没问题）；柱温和流速降低均可对分离效果产生一定的影响，但有限，仅在边缘时起作用。分离度的调节，关键还是流动相的配比。顺便提及：同样的测定条件，不同公司生产的色谱柱C18柱，出峰时间都有可能相差很大，测定结果也相差很大（尤其是有关物质的测定），这十分正常（处理方法后面详细讲解）。对一些较为特殊的柱子，质量标准中应详细注明，否则无法重现（USP）。国内虽做不到，但可在色谱条件上下工夫，以适应不同的色谱柱型号（列举不同色谱柱测定结果不一致的实例），因为药典本身规定流动相组成是可以调节的，即后面即将讲到的《药典液相色谱方法的调整》。 灵敏度高：可检测物质达10-9g左右（即ng级），一般最低检测浓度均可达10-1~10-3μg/ml（进样体积10~20μl），因此，目前有关物质的测定方法最好选用HPLC法，一者灵敏度高，二者可准确定量，易于稳定性考核的数据比较。这是紫外和薄层所无法匹敌的。有些浓度非常低的，紫外检测不到或者说紫外无法测定的，应用HPLC仪器均可得到满意的结果！如HPLC的紫外检测器也达不到测定“要求”，可通过加大进样量，调节仪器灵敏度，或使用其他检测器来解决。 色谱柱可反复使用：一般使用、维护好，均可达2年以上。 流出的组分容易收集：可用于制备色谱或价格极为昂贵的、量比较少的物质收集。 安全：仅是一些有机溶剂的污染（使用时，流动相口要密封，一者避免挥发，使流动相中各组分比例不准，二者防止污染环境），比气相要安全的多。 还有一个优点，就是成功率较高：一般条件确定好后，均可得满意的结果，这也是与气相、毛细管电泳比最大的优点（略带一下气相的知识介绍）。 自动化：现在自动进样系统，普及很快，利用好可大大地提高工作效率。一些软件的开发，也使计算大大地简便 总之： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。