膜疏水蛋白与亲水蛋白双相分离试剂盒.docVIP

膜/疏水蛋白与亲水蛋白双相分离试剂盒 货号：P060030 描述：真核组织30%以上的蛋白质为一次或多次跨膜蛋白如受体，分布于细胞膜和胞内各种质膜系统，而一些蛋白本身直接与脂质相连如脂蛋白。至少有70-80%的药物通过作用于这种膜/疏水蛋白而发挥作用。另外，许多蛋白在磷酸化、糖基化、烷基化时改变其亲水或疏水性质，由疏水趋于亲水或者由亲水趋于疏水，如蛋白转位并执行特定的功能。 膜/疏水蛋白与亲水蛋白双相分离系统(TansMem protein isolation system)提供快速简便的分离方案，在温度诱导下跨膜/疏水蛋白质选择性与亲水蛋白分离。真核组织、酵母细胞在非离子型去垢剂存在下裂解，冰上孵育10分钟；然后37度孵育30分钟，室温12000 rpm离心数分钟。溶液分为两相，亲水胞浆蛋白在上层水相，而跨膜蛋白和疏水蛋白质分布于下层相。由于下相体积极小，跨膜/疏水蛋白被选择性分离的同时也被高度(20倍以上)富集。整个过程不超过1小时。此试剂盒用于选择性分离膜/疏水蛋白与亲水蛋白、蛋白转位、2-D胶、Western Blot等研究。适用于动物、植物、细菌、酵母等各种组织。 适用：选择性分离跨膜/疏水蛋白与亲水蛋白、蛋白转位、2-D胶、Western Blot等。 规格 50 assay, 25 ml Lysis buffer；100 ml Dilution buffer, One assay is sufficient for (1) 20-50 mg动物组织，(2) 0.05 ml 湿润的细胞沉淀，适于真核细胞、酵母、细菌，(3) 50~200 mg 植物组织。 保存：4 oC 分离操作： 切记：预冷的Lysis和Dilution buffer是提取成功的关键。Lysis和Dilution buffer应储存于4°C，提取前应该仔细检查，溶液应该均匀透明，如果出现混浊应该将Lysis和Dilution buffer放在冰水浴15分钟，期间翻转瓶子数次使液体均匀冰冷。以下步骤按照推荐的温度操作绝对重要，不正确的温度将导致失败。可按比例加大或缩小提取规模。不足量的Lysis buffer将导致不充分裂解和低蛋白产率。 在一小离心管内加入0.5 ml Lysis buffer，可用于裂解：(1) 20-50 mg动物组织。(2) 0.05 ml 湿润的细胞沉淀，真核细胞、酵母、细菌。(3) 200 mg 植物组织应先在液氮中研为粉末。但植物组织用量的上限变化甚大。某些新鲜植物组织含水量甚高，而较干燥的植物组织50mg可能已经接近上限。软组织、叶片、花、多汁组织、发芽种子等可直接加入Lysis Buffer研磨破碎，而坚硬的植物组织如种子、木质茎干等最好先在液氮中研磨破碎为粉末。 按下列方法之一裂解组织：(1) 玻璃匀浆器：放入剪碎组织，加入0.5 ml Lysis buffer，放置冰上，上下手动匀浆组织10-20次。应略微多加一些裂解液以补充裂解产物粘在器皿壁上造成的体积丢失。(2) 超声破碎仪：放入剪碎组织，加入0.5 ml Lysis buffer，放置冰上，每次超声30~40秒，共3~4次。(3) 内切式高速机械匀浆器：将组织放入塑料或玻璃试管内，试管置冰浴烧杯中，加入0.5 ml Lysis buffer，将内切式分散器头垂直插入管内溶液中间并与组织块接触，转速12,000-20,000 rpm，缓慢上下移动试管10-20次，直到大部分组织打散。适于大规模提取。(4)研钵：液氮冻存组织研成粉末，倒入加有0.5 ml Lysis buffer的离心管内，或可转移到玻璃匀浆器继续研磨。注意：用玻璃匀浆器和超声仪可能比液氮研磨方便。注意某些细胞类型需要更剧烈的破碎条件，如细菌比动物细胞难以破碎，一些坚硬的植物组织难以破碎，酵母破碎可能需要使用玻璃珠。 将裂解组织液转移于小管，放冰水浴。加入等体积冰冷的Dilution buffer (0.5 ml)，总体积1ml。振荡3次，每次30秒，振荡间歇期间离心管放冰水浴。振荡完毕后离心管放冰水浴10分钟。 12,000 rpm离心5分钟，4°C，将上清液转移到新管，弃沉淀。注意保持离心温度4°C。 然后，将装有上清裂解液的小管置于37°C水浴，不时振荡3次，每次30秒。37°C孵育20 min，溶液分为两相。 12,000 rpm离心5 min，30°C。离心温度必须至少大于25°C以上。 离心后溶液必须分为两相，否则应在重复步骤4-5。上层水相含亲水性蛋白，下层油状相约50(l含有疏水性蛋白。取出上层水相转移到新管，此管为亲水性蛋白并做标号，?70°C保存。如果不需要亲水性蛋白也可以丢弃上层水相。两相中间或管底有碎片或沉淀，可去除之或不予理会。勿触动下层油状相，也可以将下层油