第六章 同核核磁实方法.docVIP

第六章 同核核磁实验方法 通常所谓同核核磁谱指的是1H同核谱，因为一般有机物富含氢，而1H的天然丰度达99.98%，而且1H的旋磁比最大，因而核磁信号最强。其他核的核磁信号的检测相对来讲都比较困难，尤其是蛋白质中有意义的如13C，15N的天然丰度分别只有1.11%和0.36%,相对1H的检测灵敏度只有0.0159和0.00104，因此要检测蛋白质中的13C及15N一定要有同位素标记才行，而且还需长时间累加。 一般同核谱可研究的蛋白质分子量的上限在1万左右，当然还要求蛋白质在溶液中有足够的溶解度，化学位移的分布比较分散。蛋白质中质子的化学位移基本上是random coil的化学位移加上不同构象的影响。如(折叠多的蛋白质同(螺旋多的蛋白质相比，化学位移更为分散，谱峰也更容易解析；同种氨基酸残基多的蛋白质，即使分子量较小，由于化学位移可能会比较密集，谱峰解析可能比稍大一些的蛋白质还要困难。 已经发表的脉冲序列有上百，但通常可以看作常规实验的为数不多。 6.1 一维氢谱 在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱，通常蛋白质溶于水或适当的缓冲液，加5-10%的D2O作为锁场介质。一维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度，通常16－32次采样要能得到足够信噪比的谱图，甲基由于快速旋转呈现窄峰，而酰胺质子由于化学交换及14N的标量弛豫呈现宽峰； 一维氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否合理，蛋白质在高浓度下容易聚集从而增宽谱线，严重时甚至1H谱上看不到明显的峰，样品在这种条件下显然无法进行核磁研究；一维氢谱还可用于判别样品的化学位移分布情况，可判别样品是否变性，同时也对研究工作的难度提供一些预测。 上图显示ubiquitin（一种蛋白质，76个残基）的一维谱：a 水溶液中，b 箭头所指甲基区的放大，c 8M尿素溶液中，显示变性谱。 蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰，若出现这种峰，往往是残留的小分子杂质，当然蛋白质的末端及loop区由于分子运动较快也会出现一些较尖的峰。 当样品条件不佳时，一维谱（以及若干信号强的二维谱）可用来探索适合的样品条件。 6.2 COSY型实验 6.2.1 COSY A COSY(correlated spectroscopy),是人们发明的第一种二维谱，同时也是研究蛋白质的最有用的二维谱之一。二个有J偶合的核在COSY上可产生一个交叉峰，由于蛋白质（包括多数其他有机物）中有J偶合意味着这两个核最多通过3个共价键连接，所以COSY谱对于分子结构的拓扑连接可提供非常有价值的信息。 左图是COSY的脉冲序列，只由2个90度脉冲组成，两脉冲之间是演化期，理想脉冲本身不产生其他杂信号，故不需相循环抑制：因此基本的相循环为： (1=x;(2=x;(ref=x 实际上由于演化期的弛豫以及第一个90度脉冲的不准确会产生轴峰，需要用2步循环抑制：第一个脉冲及接收机相位同时反转 通常还加上CYCLOPS循环以抑制硬件不平衡产生的其他杂信号 这样形成8步循环： (1= 0 2 1 3 2 0 3 1 (2= 0 0 1 1 2 2 3 3 (ref= 0 2 1 3 2 0 3 1 二维谱有幅度谱和相敏谱之分，由于相敏谱的分辨率高，通常要尽量用相敏谱。 B 以下是可以在Bruker核磁谱仪上用于记录蛋白质COSY谱的脉冲程序，脉冲序列在Bruker谱仪上称作微程序: ;cosyprst.WJH #include Avance.incl “p2=p1*2” “d0= in0/2 - p1*4/3.14159” “d11=30m” “d12=20u” “d13=3u” “l3=(td1/2)” 1 ze 2 d11 3 d11 4 d12 pl9:f1 d1 cw:f1 d13 do:f1 d12 pl1:f1 p1 ph1 d0 p1 ph2 go=2 ph31 d11 wr #0 if #0 ip1 zd lo to 3 times 2 d11 id0 lo to 4 times l3 exit ph1= 0 2 2 0 1 3 3 1 ph2= 0 0 2 2 1 1 3 3 ph31=0 2 2 0 1 3 3 1 C 脉冲序列分析 a 二自旋体系 考虑相循环的第一步 第一项为纵向磁化，第二项为多量子项，均不能被观测到； 第三项仍然是第一核的横向磁化，在检测期的频率同演化期类似，均是第一核的，对应于对角峰； 第四项是第二核的反向磁化，在检测期的频率为第二核的化学位移，与演化期不同，对应于交叉峰，这是二维谱最有意义的峰。 进一步将后两项的系数分解： 可见，对角峰在F1维位于(1，同相裂分成两个成分，距离2(J12； 而交叉峰在F1维也位于(1，但反相裂分成两个