RASSF1A在人囊癌组织及细胞中的表达.docVIP

RASSF1A在人胆囊癌组织及细胞中的表达±12.6岁，提取RNA组织。半定量RT-PCR检测胆囊癌组织中RASSFlA mRNA表达1 材料与方法 实验材料 胆囊癌及慢性胆囊炎组织标本来源 0.8 cm×0.80 cm×0.8 cm。包括20例胆囊癌组织及其癌旁组织，其中男6例，女14例，年龄41岁～72岁，平均58.4±12.6岁，所有胆囊癌患者术前均未接受任何放疗及化疗，同时患者的临床病历资料完整，术后经病理诊断证实所有病例均是胆囊腺癌。取多份组织标本，置于DEPC处理过的冻存管中，液氮冷冻保存，用于RT-PCR分析。 1.1.2 细胞株 胆囊癌细胞株GBC-SD、NOZ购自ATCC。胆囊癌细胞株TGBCITKB、OCUG1为本实验室保存。 1.2 主要方法 1.2.1 组织总RNA提取 于12000 rpm、4条件下离心15，离心后混合液分三层底层红色的酚-氯仿相中间相和无色的上层水相。RNA只存在于上层水相中，水相体积约为加入TRIzol体积的60%水相入一个干净的离心管中，按照比例加入异丙醇TRIzol : 异丙醇，混匀15-30℃下静置10于12000×g、4条件下离心10，沉在管底管壁胶状物RNA沉淀RNA洗涤：倒掉上清液，TRIzol等体积的75%乙醇（无RNA酶水配制），振荡混匀于7500×g、4条件下离心5，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温自然干燥5-10，因RNA完全干燥后很难溶解注意不让RNA完全干燥重新溶解RNADEPC处理过的水NanoDrop 2000测RNA浓度，具体步骤为：启动电脑，运行NanoDrop 2000软件，并选定测RNA；使用RNA free的水洗测试头3次，并使用无尘纸擦干；使用0.1% DEPC水作为空白对照调零；吸取1 (l的待测样品加到测试头上，选择测量，读取数值保存为Excel表； RNA浓度计算公式为：RNA（(g/(l）=OD260×样品稀释倍数×40/1000；琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 完整性。 1.2.3 逆转录反应 按下表的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心 试剂 每管加入量 μg/ml) 1 μl 10 mM dNTPs 2 μl RNA样品 2 μl 加入无RNA酶的H2O至14 μl，70℃ 5 min，迅速置于冰上冷却 5×RT buffer 4 μl RNasin 1 μl M-MLV-RTase 1 μl 总体系 20 μl 42℃反应60 min，然后在70水浴锅中水浴1min，使RT酶失活将得到RT产物cDNA置于-80保存备用1.2.4 引物设计 引物序列 产物长度 RASSF1A-F 5’-AGTACAATGCCCAGATCAACA-3’ 288 bp RASSF1A-R 5’-CCACCACCAAGAACTTTCG-3’ GAPDH-F 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’ 226 bp GAPDH-R 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ 1.2.5 半定量RT-PCR检测胆囊癌组织中RASSFlA mRNA表达 反应体系样品及试剂 用量 2.5 μl dNTP(2.5mmol/l) 2.0 μl 目的基因引物（10μM） Sense（10μM） 1μl Antisense（10μM） 1μl cDNA模板 3.0 μl Taq酶 0.2 μl ddH2O 10.3 μl 总体系：20 μlPCR扩增条件94℃ 10 min；94℃ 15 s；；循环次μl经2％琼脂糖浆凝胶电泳鉴定，用电泳成像拍照并用Kodak1D 3.5专用软件进行图象分析。 1.2.6 细胞培养 分别将各株细胞用DMEM培养液（含100 ml/L小牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素）制成单细胞悬液，接种于25 ml玻璃培养瓶，在5％ CO2浓度、37 °C、湿度饱和的条件下培养。 1.2.7 荧光定量PCR (1) 细胞总RNA抽提和逆转录 同1.2.1，1.2.2，1.2.3。 (2) SYBR Green掺入法荧光定量PCR样品及试剂 用量 ddH2O 6 μl SYBR Green Master Mix 10 μl 目的基因引物（10 μM） Sense（10 μM） 1 μl Antisense（10μM） 1 μl 样品溶液 2 μl 总体系：20 μl 扩增条件95℃，10 min；9℃，15 s；55℃1 min；℃，20 s；循环40次。荧光定量PCR拷贝数，根据标准曲线获得。每个样品的目