《基因工程》教案.docVIP

第一章 绪论 基因工程(genetic engineering)和遗传工程的英语中是同一个词汇。从字面上看,遗传工程就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。遗传是由基因决定的，改建生物的遗传性是改建生物的基因，因此狭义的遗传工程就是基因工程。? ? ?对多数生物来说，基因本质是DNA，基因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列的重新组合和建造，所以基因工程的核心就是人工的DNA重组（DNA recombination）。? ? ?重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。所以DNA重组和分子克隆是与基因工程密切不可分的，是基因工程技术的核心和主要组成部分。重组DNA、分子克隆甚至成了基因工程的代名词。 ? ? ?只有当人类对遗传现象本质和规律有深入的认识，才能按人类的意志去改造或创建生物的遗传特性。20世纪50-60年代分子遗传学的迅速发展，确定了主要遗传物质DNA的双螺旋结构、阐明了遗传信息传递的中心法则、破译了遗传密码，为基因工程奠定了理论基础；同时酶学、细菌学、病毒学的发展，为基因工程提供了必要的工具。1972-1973年Boyer、Cohn和Berg等创立了DNA克隆技术，打破了种属的界限，第一次使本来只存在于真核细胞中的蛋白质能够在大肠杆菌中合成，这是基因工程诞生的里程碑。科学界公认基因工程的出现是20世纪最重要的科学成就这一。标志人类主动改造生物界的能力进入新的阶段。分子生物学的成就是DNA重组技术和基因工程出现和发展的基础，而DNA重组技术和基因工程的发展又有力地推动着分子生物学的进步。? ? ?基因工程属于生物技术范畴，生物技术（biotechnology）不是一个独立的学科而是一套技术或手段。广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。如无特别说明，通常生物技术一词就专指新的生物技术而言。一般认为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出。蛋白质工程（protein engineering）则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。 基因工程技术涉及以下步骤： 1．从生物体的基因组中分离目的DNA序列（基因）。这通常包括DNA的纯化技术，酶促消化或机械切割，以游离目的DNA序列。 2．建立人工的重组DNA分子（有时称为rDNA），即将目的基因插入一能在宿主细胞中复制的DNA分子，即克隆载体。对细菌细胞来说，合适的克隆载体有质粒和细菌噬菌体。 3．将重组DNA分子转到合适的宿主中，如大肠杆菌。当利用质粒时，对一重组的病菌载体来说此过程又称为转化或转染。 4．利用细胞培养技术，培养筛选转化的细胞。一个转化的宿主细胞能生长并产生遗传上相同的克隆细胞，每个细胞都携带着转化的目的基因，此技术就是常指的“基因克隆”或“分子克隆”。 二、DNA的提取和纯化： 从细菌中分离纯化质粒DNA的主要步骤： 1. 细胞壁的消化，将细菌温育在裂解液中去除细胞壁中的肽聚糖。通常在等渗的情况下进行此步，以防止细胞涨破释放出染色体DNA分子。注意，革兰氏阳性菌对裂解酶相对不敏感，需要额外的处理以使酶到达细胞壁层，例如，可采用渗透压休克或保温在螯合剂中，如EDTA。EDTA也能使一些细菌的脱氧核糖核酸酶失活，以防止在提取过程中，质粒DNA降解。 2. 利用强碱（NaOH）和其他试剂，如十二烷基磺酸钠溶解细胞膜并使蛋白质部分变性。再中和此溶液使不溶性染色体DNA沉淀，质粒DNA存于溶液中。 3. 移去其他的大分子物质，特别是RNA和蛋白质，这可利用核糖核酸酶和蛋白酶进行酶促消化。另一些化学纯化步骤可增加质粒DNA的纯度，例如可将提取物同水饱和酚或酚/氯仿混合物混合，以除去蛋白质。再离心，DNA留在上面的水层，蛋白质则分离在下面的有机溶剂层。重复酚/氯仿提纯的循环可降低样品中这些大分子蛋白的含量到最少。还可通过等密度的CsCl梯度离心法得到纯化的DNA。 4. 利用体积分数为70%左右的乙醇沉淀DNA，离心，得到的DNA沉淀，再用体积分数为70%的乙醇洗，其中的水将除去先前阶段的盐污染。经过提纯的DNA，可冷冻保存备用，或重新溶解在缓冲