细菌分离教案.docVIP

2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 导言：上节课我们学习了微生物在实验室培养的相关基础知识。今天我们就把理论来指导实践，对土壤中分解尿素的细菌进行分离。 为什么要分离出这类细菌呢？它们有什么特点？ 课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶。 弄清了这类细菌的特征后，如何将它们从众多的微生物种类中分离出来呢？要知道，土壤是微生物的大本营，其中微生物的种类和数量是非常非常多的。 一、研究思路 联系选修三，当时进行DNA体外扩增时也遇到相同的问题，普通的DNA聚合酶无法适应高温的反应条件。最后我们是怎么解决这个问题的？ 1、实例： PCR是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技要求使用耐高温DNA聚合酶。 原因：因为热泉温度为70～80℃，淘汰了绝大多数微生物，而使Taq细菌被筛选出来。 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 由此，在实验室中我们总结了微生物筛选的原理。 2、实验室中微生物的筛选原理： 原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 方法：⑴造成有利于该菌生长的环境；⑵抑制大多数微生物不能生长利用选择培养基分离 e.g培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物。 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： 课本P22“选择培养基成分” ①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 ③培养基选择分解尿素的微生物的原理（学生归纳） 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。 缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制。 用选择培养基将微生物筛选出来后，通常还要计数微生物的数量。可是微生物个体微小，用肉眼甚至借助显微镜也难以看清，怎么办呢？ ㈡、统计菌落数目： 1常用方法：稀释涂布平板法 统计依据： ①当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 ②通过统计菌落数来推测样品中活菌数。 统计方法： 一般选择菌落数在30-300的平板进行计数。 数据比实际数目少。（有些菌落生长得比较接近，肉眼无法区分） 结果表示：一般用菌落数表示。如：99个（菌落）/板 2显微镜直接计数： 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 可根据实际情况和需要选择合适的计数方法。 二.实验的具体操作 ㈠.土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 ㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 （三）样品的稀释：按梯度稀释方法进行稀释 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 （四）取样涂布 ◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。 （五）微生物的培养与观察 菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 计算公式：(C/V) ×M 常见微生物菌落形态介绍（略） 2NH3 + CO2 + H2O 脲酶 CO(NH2)2