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南京林业大学2011届毕业论文答辩PPT 题目：石竹属DNA指纹图谱构建 学生：朱烨 指导老师：徐立安 教授 2011年6月3日 汇报的主要内容 1. 研究的目的及意义 2. 研究材料与方法 3. 结果分析 4. 讨论 1. 目的及意义 目的：利用SRAP和ISSR分子标记法构建石竹属DNA指纹图谱 意义：此图谱的构建，一方面，为今后石竹属种间鉴定提供快速、科学的参照标准。另一方面，也为香石竹（康乃馨）杂交育种提供亲缘关系的遗传背景材料。 2. 研究材料与方法 研究材料：从新疆乌鲁木齐、木垒、霍城、尼勒克、唐布拉、阿尔泰、布尔津、小东沟、庙儿沟等地采集野生石竹的种子，共计 10个种 。 研究方法：DNA提取与纯化 ， PCR反应正交设计，电泳检测和指纹图谱构建 DNA的提取与纯化 采用改进的CTAB裂解-硅珠吸附法从新鲜的叶片中提取总DNA PCR反应的正交设计 SRAP-PCR反应 ：针对影响PCR反应Mg2+、dNTPs、引物和Taq聚合酶4个因素，选用L9(34)在3水平上进行实验。使用的引物组合为Me6/Em1。L9(34)设计表见表 : 电泳检测 ISSR琼脂糖凝胶检测 SRAP聚丙烯酰胺凝胶检测 指纹图谱的构建 位点统计法： 根据每对引物生成带型间的差别直接对带型进行 分类编号，可得到每个种的带型编号。一个种的 DNA经过不同引物扩增后，将获得一系列带型编 号，按照固定的引物序列，串联各带型编号,形 成一组数据。将这些图谱转换为由 1 和0 组成的 字串，构成数字指纹图谱。 3. 结果分析 正交实验结果与分析 指纹图谱的构建 正交实验结果与分析 SRAP-PCR反应 ：选取Me6/Em1作为扩增引物，以同一个种不同家系的4个DNA进行扩增，电泳图如图 ： 指纹图谱构建 SRAP数字指纹图谱 4.讨论 分子标记的体系优化：利用正交验直观分析方法，能迅速获得满意的试验结果，而且具有试验规模小，节省人力物力 的优点。但该方法亦有一定的局限性，如对试验结果本身优劣的判断带有主观上的成分 ，故选出的组合不一定是最优的 。 指纹图谱构建：通过两种分子标记的在有效引物比例、扩增出条带的稳定性和清晰度、指纹图谱的种间鉴别力 等方面的对比，可以证实SRAP标记优于ISSR标记 。 * * 0.15 0.20 0.25 0.25 0.15 0.20 0.20 0.25 0.15 0.5 1.0 1.5 1.0 1.5 0.5 1.5 0.5 1.0 0.15 0.25 0.35 0.15 0.25 0.35 0.15 0.25 0.35 1.5 1.5 1.5 2.0 2.0 2.0 2.5 2.5 2.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 dNTP（mmol/L） Taq酶（U/L） 引物(μmol/L) Mg2+(mmol/L) 组合编号 ISSR-PCR反应：针对影响PCR反应Mg2+、 dNTPs、引物和Taq聚合酶4个因素，选用 L9(34)在3水平上进行实验。使用的引物编 号为855。L9(34)设计表见表 : 0.325 0.375 0.425 0.425 0.325 0.375 0.375 0.425 0.325 0.5 1.0 1.5 1.0 1.5 0.5 1.5 0.5 1.0 0.4 0.6 0.8 0.4 0.6 0.8 0.4 0.6 0.8 1.25 1.25 1.25 1.75 1.75 1.75 2.25 2.25 2.25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 dNTP（mmol/L） Taq酶（U/L） 引物(μmol/L) Mg2+(mmol/L) 组合编号 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 根据电泳图，经过极差分析可知： SRAP-PCR反应中，对反应影响最大的是Mg2+,引物，之后dNTP,最后是Taq酶。4个组分的最佳反应水平为： Mg2+2.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L、引物0.25μmol/L、Taq酶为1.0U。 ISSR反应：选取855作为扩增引物，以同一个种不同家系的4个DNA进行扩增，电泳图如图 ： M 1 2 3