锦鲤竖鳞病疫苗制备与免疫效果研究.pdfVIP

锦鲤竖鳞病疫苗制备与免疫效果研究 梁拥军 孙向军 史东杰 马峻峰孙砚胜 (北京市水产科学研究所) 摘要：锦鲤是观赏渔业的主养品种之一，竖鳞病是其产业化养殖过程中的常见疾病，据相关资料显示， 引起锦鲤竖鳞病的多数为点状假单胞菌，本试验通过点状假单胞菌菌体扩繁，利用紫外线灭活13min， 制备锦鲤竖鳞病疫苗。川该疫苜免疫锦鲤，进行活菌悬液攻毒，锦鲤成活率80％，并对该疫苗进行免 疫效果分析，免疫抗体效价高达l：64。 关键词：锦鲤竖鳞病疫苗制备 在日常生产实践中，竖鳞病是危害锦鲤生长发育、造成大量死亡的重要疾病。受感 染的锦鲤发病周期短，传播速度快，感染范围广，死亡率高，特别是锦鲤亲鱼死亡率最 高可达85％。相关资料显示：导致此病有几种病原体，包括如点状假单胞菌、产气单胞 菌等，均可单一或共同导致锦鲤细胞感染，致使内部器官功能失调。为克服使用中西药 对锦鲤体色、体型产生的不良影响，我们通过对患病锦鲤病灶细胞的菌株进行疫苗制备， 并对所制备的疫苗进行了免疫效果分析，旨在为防治锦鲤竖鳞病提供一种有效的免疫学 方法。 一、材料和方法 1、材料 1．1菌株：由天津农学院水产系通过对患病锦鲤进行病灶取样、细胞培养、提纯、扩 繁，最后经血清学鉴定，引起此锦鲤竖鳞病的细菌主要为点状假单胞菌。 1．2试验鱼：由北京市水产科学研究所小汤山良种繁育中心提供，均为1龄鱼，试验 前在水泥池中暂养一个月，确保健康无病。 1．3试验条件：水泥循环池7个，面积均为18m2，长6m，宽3m，水深O．5～O．6m， 然温泉养殖，水温控制在12～13℃，利用气泵充氧，Do保持在5mg／L，试验期间将水循 环关闭，不喂食。 2、方法 白对照池，确保没有点状假单胞菌，连续观察5d。 2．2制备疫苗 2．2．1菌体扩繁：点状假单胞菌进行无菌操作，划线接种于普通琼脂培养基，在生化 培养箱中34℃培养24hr，将生长出的形态特征明显的菌落接种于肉汤培养基中，34。C进 行旋转培养(120r／min)24hr，然后在室温下2000r／min离心30min，保留菌体沉淀，并 用0．75％的NaCI溶液洗涤菌体3次，最后采用菌落计数法进行计数。 度，放置在无菌室紫外灯下照射13min，进行灭活，菌苗放在4。C的冰箱中保存备用。 2．2．3安全试验：4#池每尾鱼腹腔注射疫苗O．3mL，暂养5d观察鱼体反应。 2．3免疫试验 mL 5#池每尾鱼腹腔注射疫苗O．5mL，暂养10d后，全部心脏采血，血液收集于50 洁净的离心管中，于4℃冰箱静置24hr后，4。C，3000r／min离心30rnin，收集离心管上 清液，保存于．80℃超低温冰箱中备用。 6#池为对照组，利用同样的方法收集并保存血清。 2．4免疫效果的检测 2．4．1免疫保护效果检测： 109cfu／mL， 菌攻毒试验，每尾鱼再用未灭活的菌苗进行腹腔注射0．5mL，浓度为1．0X 暂养15d左右，记录7#池锦鲤成活率。 3#池为对照组，在对7#池进行致病菌攻毒试验的同时，对3#池每尾鱼同样用未 鲤成活率。 2．4．2免疫抗体效价检测： #池)血清。 用微量血凝板倍稀的方法检测疫苗(免疫抗体)的效价。取出微量血凝板，每孔中 加入O．05 109cfu／ 0．05mL，最后将微量血凝板加盖于32℃恒温培养箱中孵育过夜，用低倍显微镜观察凝集 反应强度，并记录。 二、结果 1、病原菌攻毒试验： 1#池、2#池锦鲤5d内全部被感染并陆续全部发病死亡，症状为：感染鱼体体表用 手摸有粗糙感；鱼体后部部分鳞片向外张开像松球，鳞基部水肿，以致鳞片竖起，稍加 压力，渗出液就从鳞片基部喷射出来，鳞片也随之脱落，脱鳞处形成红色溃疡，并常伴 有鳍基充血，皮肤轻微充血，眼球突出，腹部膨胀，腹腔积水，游动迟缓，呼吸困难， 身体翻转，腹部向上等，与天然感染极为相似。3#池锦鲤无异常