介孔氧化铁材料快速_高效富集分离磷酸化肽段和蛋白的新方法研究.pdfVIP

第 36卷 分析化学 ( FENX I HUAXU E) 　研究报告 第 7期 　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　 2008年 7 月 Ch ine se Jou rnal of A nalytical Chem istry 885 ～889 介孔氧化铁材料快速 、高效富集分离 磷酸化肽段和蛋白的新方法研究 单 喆 　韩 路 　于锡娟 　屠 波 　赵东元 　杨芃原 (复旦大学化学系 , 上海 200433) μ β 3 - 摘 　要 　以 0. 1 mol/L ca sein磷酸化蛋白酶解液为对象 ,利用在酸性条件下对 PO4 能够特异性吸附的氧 化铁材料为新载体 ,对介孔氧化铁材料富集分离磷酸化肽段的孵育液酸含量 、孵育液有机溶剂含量和洗脱液 选择的条件进行了优化 ,结果表明:室温条件下 ,在含有 0. 1% 乙酸和 30% 乙腈的孵育液中孵育 5 m in 后 ,经 1 mol/L NH ·H O 溶液的洗脱 ,介孔氧化铁可有效地将磷酸化肽段从蛋白酶解液中富集分离 。本方法也可 3 2 α 以选择性地提取 ca sein磷酸化蛋白,实现了简单 、快速 、高效的磷酸化肽段和蛋白的富集分离 。同时 ,通过 MALD ITOF 串级质谱分析 ,成功地完成了在优化条件下分离出的磷酸化肽段磷酸位点的鉴定 。 关键词 　基质辅助激光解吸飞行时间质谱 ,介孔氧化铁 ,磷酸化肽段 ,磷酸化蛋白,快速富集分离 1　引　言 磷酸化修饰是生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰之一 [ 1～4 ] ,是 目前蛋白组学研究的一个重要内 容 。由于磷酸化蛋白在生物体内的含量很低 ,在用 MALD ITOFM S分析磷酸肽时 ,磷酸肽的信号容易 被其它高丰度的非磷酸化肽段所抑制 [ 5, 6 ] 。因此 ,必须对磷酸化蛋白经酶解或降解后所得多肽混合物 中磷酸化肽进行有效地富集分离 。目前 ,一些磷酸化肽段富集分离方法和技术已有报道 [ 7～10 ] ,其中最 广泛采用的技术是固定金属亲和色谱法 ( MI AC) 。但该方法操作复杂 , 需要经过多步的活化 、冲洗 、洗 脱过程 ,费时费力 。因此 ,寻求新的简便 、高效的磷酸化肽段富集分离方法十分重要 。 Horanyi等 [ 11 ] 发现 ,在酸性条件下 , Fe O 材料表面对 PO3 - 具有很强的特异性吸附 ,这一特性使得 2 3 4 氧化铁可能作为富集分离磷酸化肽段和蛋白的候选载体 ,但有关此研究尚未见报道 。本研究利用介孔 氧化铁微球富集分离磷酸化肽段和蛋白,通过对实验条件的优化 ,经 MALD ITOFM S鉴定证明取得了理 ( ) 想的富集分离效果 。与传统 Fe Ⅲ MI AC相比,使用介孔氧化铁的富集分离过程中 ,消除了反复活化 载体 、冲洗非磷酸化肽段的步骤 ,是一种简单 、快速 、高效分离磷酸化肽段和蛋白的方法 。 2　实验部分 2. 1　仪器与试剂 ( ) App lied B io