卡介苗对膀胱癌细胞Toll信号通路相关膜分子基因表达影响.pdfVIP

卡介苗对膀胱癌细胞Toll 信号通路相关膜分子基因表 达影响1 危建安，曾星，韩凌，黄羽 广州中医药大学第二附属医院中心实验室，广州（510120 ） E-mail ：andycarrie@163.com 摘 要：目的 探讨卡介苗对膀胱癌细胞株T739 Toll 信号传导相关膜分子TLR2 、TLR4 、 CD14 和MD-2 mRNA 基因表达影响。方法 采用SYBR Green 嵌合荧光定量Real Time-PCR ， 观察BCG(0.25mg/ml)刺激T739 后不同时间点各个mRNA 相对表达量（Ratio ），设LPS 和 空白组作对照。结果 BCG 组 TLR2 、CD14 和 MD-2 mRNA 在 BCG 刺激后表达增加， Max.Ratio 分别为5.3(2h), 2.6 (4h), 7.4(2h)，TLR4 无明显变化；LPS 组CD14 和TLR4 表达 增加，Max.Ratio 分别为2.1(1h) ，3.2(6h)，TLR2 和MD2 无明显变化。空白组上述基因各时 间点Ratio 无明显变化。结论 BCG 和LPS 作用T739 的受体不同，推测卡介苗可经TLR2 激活膀胱上皮细胞Toll 信号通路。 关键词：卡介苗；膀胱癌；信号传导；基因表达 中图分类号：R737.14 卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)膀胱内灌注治疗和预防浅表性膀胱癌，是目前较 成功的肿瘤免疫治疗。其作用认为与 BCG 诱导并增强了免疫反应尤其是局部的细胞免疫有 关，但尚不能完整阐释其机理。天然免疫的研究发现[1] ：上皮、内皮细胞等可通过其表面的 钟声蛋白样受体(toll-like receptors，TLRs)识别与其接触的病原微生物，产生免疫反应。我们 推测卡介苗(BCG)也可能刺激膀胱移行上皮细胞 TLRs，通过激活 Toll 信号传导通路并启动 获得性免疫而增强抗肿瘤免疫反应。因此本研究拟用 BCG 刺激膀胱癌细胞株 T739，探讨其 对 Toll 信号传导相关膜分子 TLR2、TLR4、CD14 和 MD-2 mRNA 基因表达影响。 1. 材料与方法 1.1 材料与主要试剂仪器 实验用膀胱癌细胞株(BTT-T739，简称T739)源于小鼠低分化移行上皮细胞膀胱癌，购 [2] 自上海市第一人民医院中心实验室 ，卡介苗为本室保存。革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)为 Sigma进口分装。RNAprep cell kit 、DNase I、TIANScript RT Kit和SYBR Green荧光染料 qRT-PCR试剂(均购自天根生化科技公司) ；RNase H(Invitrogen公司) ；引物自行设计由 Invitrogen公司合成；RPMI 1640培养基和新生牛血清(GIBCO公司) ；其他试剂均为国产分析 纯。普通PCR仪和荧光定量PCR仪(ABI公司, 型号分别为9600和7700)；高速冷冻离心机 (BECKMAN公司) ；凝胶成像系统(BIO-RAD公司，Gel doc XR型) ；细胞培养箱(HARRIS公 司) 。 1.2 卡介苗和细胞培养 将卡介苗（BCG ）接种于Middlebrook7H9 培养基中，置于 37℃静置培养，待其生长至 对数生长期使用。在使用前收集 BCG ，用 PBS 洗涤，称重，用 1640 培养液调整培养基终 浓度为 0.25mg/ml 。T739 细胞在含 10%新生牛血清的 RPMI 1640 培养基，5% CO2 37℃的培 养箱中培养，用 0.25%胰蛋白酶消化传代细胞。分为空白组、LPS 组和 BCG 组共 3 组，空 1本课题得到教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目（20040572009 ）资助。 - 1 - 白组不加任何处理，LPS 组终浓度为 100µg/L，BCG 组终浓度为 0.25mg/ml，观察时间点为 0,1h,2h,3h,4h,6h,8h,12h 等共 8 个，每个时间点作 3 个样本，观察指标为 TLR2、TLR