实验五SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量.pdfVIP

实验五 SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量 一. 实验原理 带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是 Vq v d 6πeη 根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液( η)条件下，带电的各种蛋白质成分， 移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6 πr) 。若使各蛋白质成分的带 电量(g)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6 πr) 。1967 年 Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸纳 (sodium dodecylsulfate，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电冰迁移率则主要取决于 它的自身分子量的大小。 加人 SDS 之所以能获得如此的效应，是因为 SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水 键，使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的 SDS 相结合[溶液中的 SDS 总量，至少要比蛋白质的量高 3 倍以上，大多数蛋白质与 SDS 按 1:1.4(W ／W) 的比例结合]，形成 SDS 一蛋白质复合物。其结果： ( 1) 由于 SDS 解离后带 有很强的负电荷，致使 SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过 了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。(2)SDS 与蛋 白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。 不同 SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为 18nm ，而长轴则与蛋白质分子的 大小成正比。这样 SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷 及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。 需要注意的是：为使 SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完 全打开。因此，在用 SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。巯基乙醇是一种 还原剂，它能使二硫键还原打开，并在有多余的巯基乙醇存在时，就不会再氧化为二硫键。 蛋白质与 SDS 结合后的复合物都是易溶的，因而有利于电泳。为满足 SDS 定量地与蛋白 质结合，这种聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶及电极缓冲体系中都含有 SDS，所以称为 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳。 1969 年 Weber 和 Osborn 用此法测定了约 40 种蛋白质的迁移率，结果发现，蛋白质的 迁移率与其分子量的对数呈直线关系： —bm Mw=K(10 ) lgMw=lgK—bm lgMw=K1—bm Mw=分子量，m=迁移率，b=斜率，K ，K1=常数 用此法可以测得蛋白质的分子量。实验证明，分子量在 12 000～200 000 之间的蛋白 质，用此法测得的分子量，与其它方法测得的相比，误差一般在±10％以内，重复性高。 此方法还具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定大多数蛋白质分 子量的常用方法。 应用此法测定分子量时，首先将几种已知分子量的标准蛋白质混合物，与被测蛋白质 同时进行 SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后测出各个蛋白质成分的迁移率，再以标准蛋白 质的分子量为纵坐标，迁移率为横坐标，在半对数坐标纸上绘出一条直线型的标准曲线( 图 1)。若以普通坐标纸作图，则纵坐标应取蛋白质分子量的对数值。 图 1 扫描图于此 图 1 37 种蛋白质的分子量对数对电泳迁移率图 分子量范图 ll000—70000，10％凝胶，pH7.2 ，SDS 一磷酸缓冲系统，M 为迁移率 被测蛋白质的分子量只要测得迁移率即可从标准曲线上求出。 Weber 的实验指出，不同浓度的 SDS—聚丙烯酰胺凝胶适用于不同范围的蛋白质分子 量大小的测定。如 15％的凝胶适用于分子量在 10000～50000 范围的蛋白质；10％的凝胶 适用于分