海藻糖合成酶的改性研究%3a分子进化和半理性设计.pdfVIP

I 001 海藻糖合成酶的改性研究：分子进化与半理性设计 1,2 2 3 3 2 3 黄日波 ，韦宇拓 ，王青艳 ，卢福燊 ，蒙健宗 ，朱绮霞 3 2 卢运昆 ， 黄 鲲 （1. 广西科学院，南宁市，530022；2. 广西大学生命科学与技术学院，南宁市，530004； 3. 广西南宁中诺生物工程有限责任公司，南宁市，530004 ） 海藻糖合成酶（trehalose synthase, EC 6 ）是一种于上世纪90年代中期从微生物 中发现的新型酶，它能将底物麦芽糖的α, α−1,4−糖苷键经分子内重排而转变为α, α−1,1−糖 苷键，产物是海藻糖[1] 。我们研究小组先后从褐色喜热裂孢菌（Thermobifida fusca ）、谷氨 酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicium）和耐放射性异常球菌（Deinococcus radiodurans ） 中克隆并在不同宿主表达了海藻糖合成酶基因[2][3] 。迄今，在全世界范围内人们发现能够产 生此类海藻糖合成酶的微生物已经超过 15 种之多。这些酶的基本共同点是[2] ：一是底物转 化率最高只有80 ％左右，一般为65～75 ％；二是除了个别来自耐高温菌的海藻糖合成酶外， o 绝大多数酶热稳定性差，最适反应温度只有 25 C 左右；三是反应的时间太长，一般为 48 小时，有的长达72 小时。 以上是海藻糖合成酶在生产实践应用中遇到的三大难题。根据当今生物工程的发展水 平，能够通过单类实验一举多得地同时解决上述三个问题的只有酶的分子进化法[4] 。本研究 利用我们独立分离到的五个海藻糖合成酶基因，进行定向的分子进化筛选。酶的目标性状分 别是Kcat 值和耐高温能力的提高。在理性设计方面，由于目前数据库中尚未有任何一个海藻 糖合成酶的3D 结构，我们在进行酶的结晶与3D 结构解析的同时，应用生物信息学手段如 DiAlign2 中的新算法寻找这五个基因的进化保守区。结果发现了至少有两个区域在不同微生 物种属之间是高度保守的[2] 。我们对这两个区域（各为约35个氨基酸）进行了饱和突变 [4] 。我们把这种没有3D 结构基础的定位突变称为半理性设 （saturation mutagenesis ）的研究 计。根据酶反应动力学所揭示的酶催化机制，从关系K ‡ cat = (κT/h)exp( －∆G /RT) 中可以推测， 只有酶活性部位的氨基酸残基发生了变化，才有可能使活化能∆G‡发生变化，从而对催化常 数产生几何级数的影响[5]，酶的改性才有可能实现。初步结果表明，保守区的氨基酸发生突 变，对酶活的影响很大。 当前，国际上酶法规模生产海藻糖分为两类方法：一种是以淀粉为原料，分别通过 MTSase 和MTHase 两种酶作用之后生产海藻糖，简称双酶法；另一种是以麦芽糖为出发原 料，经海藻糖合成酶（trehalose synthase ）作用之后，麦芽糖分子中的α,α-1,4-糖苷键经分子 内重排而生成海藻糖，此法简称单酶法。 我们先后从广西温泉及土壤中分离到四个海藻糖合成酶基因，并申请了专利[12] 。广西 科研人员在酶法生产海藻糖方面已经取得较好的成果。年产500 吨的生产线已经投入运行， 年产 3000 吨的生产线正在建设之中。我们计划在三年左右的时间里将生产规模扩大到 30,000 吨。由于海藻糖的应用领域和范围在不断地拓宽，预计在今后1－2 年国内市场需求 将会有快速增长。 非常令人振奋的是，国内一些兄弟院校在酶法生产海藻糖的研发与产业化方面已经取得 了长足的进步。例如中科院微生物所已经完成了基因的克隆与表达。其他科研院所在发酵法 生产海藻糖、天然菌酶法生产海藻糖等