利用DNA重组技术构建产生多聚甘露糖醛酸的突变菌株.pdfVIP

沈洪波等：利用DNA重组技术构建产生多聚甘露糖醛酸的突变菌株 利用DNA重组技术构建产生多聚甘露糖醛酸的突变菌株① 沈洪波②韩峰林育姿韩文君于文功③ (中国海洋大学海洋药物与食品研究所教育部海洋药物重点实验室 青岛2660{)．3) 摘要本文旨在以海洋细菌Pseudomonas sp．QDA褐藻多糖(algi,mte)生物合成操纵元 中的n∽基因为靶点，利用DNA重组技术改建褐藻多糖的生物合成途径，以期获得产生 甘露糖醛酸的突变菌株。首先，利用PCR克隆n郴基因两侧大小分别为1．7kb和1．8kb 的DNA片段作为同源片段，用编码Gm抗性的aacCl基因替换础$基因，构建成打靶载 体pEXl00TUIX：。将打靶载体转入QDA，利用(知·抗生素和蔗糖为选择压力进行培养，通 株胞外产物为多聚甘露糖醛酸。该突变菌株的获得丰富了具有较高药物开发价值的甘露 糖醛酸的来源，为褐藻多糖途径工程的进一步研究提供了理论依据和技术支持。 关键i可多聚廿露糖醛酸，途径工程，假单胞菌，差向异构酶 而获得新化合物。褐藻多糖生物合成途径在铜绿假 0 引言 个基因组成一个操纵元，在GDP一甘露糖脱氢酶(甜一 褐藻多糖是由肛D一甘露糖醛酸(M)和它的C一5 驴)启动子的作用下合成褐藻多糖。其中H‘露糖醛 差向异构体“一L广占罗糖醛酸(c)两种单体组成的线酸C一5差向异构酶Al$的功能是将多聚甘露糖醛 酸进行异构化，使其部分转变为古罗糖醛酸r91，决定 性聚合物…，其分子中存在聚H‘露糖醛酸(poly．M) 嵌段、聚古罗糖醛酸(Ⅲy．G)嵌段和两种单体交替合成的褐藻多糖的M和G含量。由此，通过调节 (Mc／GM)嵌段。褐藻多糖来源广泛，目前已经在海 幽(】=基因的表达，可以控制甘露糖醛酸向占罗糖醛 带、马尾藻、巨藻等褐藻l2l中以及假单胞细菌L…、固 酸的转变途径。 氮菌”o等机会致病菌和十壤微生物巾分离得到。细 本实验以一株高产胞外褐藻多糖的海洋细菌 菌来源的褐藻多糖与褐藻来源的褐藻多糖在结构上 有所／fi同，韦要差别在于细菌来源的褐藻多糖在甘 重组打靶载体，非极性敲除褐藻多糖合成操纵元中 露糖单元的2一和(或)3一羟基上存在着不同程度的乙 的甘露糖醛酸C一5差向异构酶编码基因algG，以期 酰基修饰”J。褐藻多糖及其低聚糖已广泛应I}}!I于食 获得产生多聚甘露糖醛酸的突变菌株。 品、制药等多个领域，具有广阔的发展前景。其中甘 露糖醛酸(M)具有较高的药用价值，富含M的褐藻1材料与方法 多糖具有抗肿瘤【6J、免疫调节【71和促进造血的作 用¨J；M寡糖具有促进钙的吸收和利用、抑制破骨细 1．1实验菌株与培养条件 胞分泌的磷酸酯酶水解骨胶原、防止骨钙流失等作 1．1．1实验菌株 用。， 实验中所用野牛菌株脚以∞m∞sp．QDA为本 在次级代谢产物合成途径的遗传改造过程中， 实验窜从海水中筛选到能够产生大量胞外褐藻多糖 新兴起的途径T程技术备受瞩目。途径T程是利用 的细菌【loJ。实验所需菌株、质粒和引物见表1。 分r生物。学原理，分析细胞代谢网络，通过合理设}|‘ 1．1．2培养条件 的DNA重组，改建生物体固有的生物合成途径，从 婆g翁篓鬻靛蕊溅瓣生(30艄37158…3)猢)：j蔫昱汹。，。。。一 ④莲磊揩茹!淼掣龋…““…1 万方数据 175 高技术通讯2006年2月第】6卷第2期