NK活性测定.pptVIP

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2018-04-23 发布于重庆
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NK活性测定.ppt

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自然杀伤细胞属淋巴细胞；无特异性TCR；无须致敏即直接杀伤靶细胞。表面标记 CD3-、CD56+、CD16+ 表面受体（1）杀伤细胞活化受体（KAR）结合靶细胞表面糖类配体，促使NK发挥杀伤作用。（2）杀伤细胞抑制受体（KIR）识别自身细胞表面MHC-I类分子，产生抑制信号。主要生物学功能抗感染与抗肿瘤；免疫调节 * NK活性测定何谓NK？—NK概述 NK活性测定实验原理实验材料及试剂实验步骤及结果判读 NK细胞的表面标志杀伤细胞抑制性受体（KIRs） NK细胞识别正常细胞 NK细胞识别靶细胞 NK细胞通过ADCC作用杀伤病毒感染的靶细胞 NK细胞杀伤靶细胞电镜图胞核 125I释放法荧光染料释放法 NK细胞+靶细胞靶细胞溶解、破裂释放胞浆内酶类 LDH释放法胞浆内蛋白 51Cr释放法实验原理效应细胞靶细胞释放LDH 乳酸乳酸脱氢酶 LDH NAD+ NADH+H+ PMS NBT 甲替（OD570nm）丙酮酸实验材料 1、LDH底物溶液（临用前配制） 2、1% NP-40 3、1mol/L柠檬酸终止液 NBT（硝基氯化四氮唑蓝） 4mg NAD+（氧化型辅酶I ） 10mg PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1mg 混匀后取1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml 加入2mlddH2O溶解加入0.1mol/L pH7.4的PBS至10ml 实验步骤效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）靶细胞的制备效-靶细胞相互作用酶促反应结果判读取培养24~48hr的靶细胞 K562 , 洗涤3次（1000rpm×10min）, 最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml, 备用。靶细胞的制备：效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）采集静脉血2ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中，将管倾斜45°，沿管壁缓缓注入抗凝血离心2000rpm×20min 密度梯度离心分离淋巴细胞亚群用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度（加入0.2ml完全RPMI-1640 ，混匀）将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次 2000rpm×5min 用毛细吸管轻轻吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞（灰白色层） *