PCEDGGE检测饲料中的激素对渔池微生物多态性的影响.docVIP

PCE-DGGE 檢測飼料中的激素對漁池微生物多態性的影響 张仲彬 张鸿业 理学院 2007生物技术 现代人工养殖渔业越趋发达,而大部分养殖场用的饲料都人工加入了雌激素等可以增加鱼类肉质的激素类药物,而激素可能对池塘土壤中的微生物造成不良影响, 微生物是自然界的分解者, 而鱼群的排泄物更需要微生物来分解,如果渔池土壤中的微生物种类和数量大幅度减少, 会导致排泄物过多造成磷污染,做池水富营养化, 藻类过份生长做鱼群生存环境受到影响, 更甚者做成恶性循环,使该池永久不适合鱼类生长. 本实验就是通过PCR-DGGE变性梯度凝胶电泳技术对环境相近的天然和人工渔池进行土壤微生物多态性的比较, 从而反影饲料对微生物的影响,指导改善饲料的制作工艺. 分子生物学技术方法如PCR2DGGE[4 ] , PCR2SSCP[5 ]和PCR2RFL P[6 ]使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。本研究采用的变性梯度凝胶电泳(DGGE) 技术以土壤微生物群体的基因组DNA 为研究对象, 通过比较不同土壤中各种微生物的16S rRNA 基因信息来了解微生物的多样性。具体研究思路如下: 从土壤样品中直接提取出土壤微生物群体的基因组DNA, 选择对大多数细菌的16S rRNA基因V3 区能有效扩增的引物进行特异性的PCR扩增,然后对PCR产物运用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术进行分离和鉴定, 从而得出土壤微生物群体多样性的信息。 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对PCR产物分离进行分离, 其主要原理基于在含有浓度线形递增的变性剂(尿素和甲酰胺的混合物)的聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 部分解链的双链DNA 分子的电泳迁移率降低; 而序列不同的DNA 分子有着不同的解链行为, 它们在凝胶的不同位置停止迁移[7 ] , 从而使长度相同而序列不同的DNA 片段分离。由于各类微生物(如细菌和古细菌) 的16S rRNA 基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异, 所以土壤中不同微生物的16S rRNA 基因的V3区的扩增DNA 片断在DGGE 中能够得到分离, 根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出样品中微生物的种类多少, 粗略分析土壤样品中微生物的多样性。为此, 本文从探索方法的角度出发, 选用不同的土壤样品对DGGE 这一技术在土壤微生物多样性的研究中应用作以初步的尝试, 为后续的精确研究微生物的多样性打下良好的实验基础。 1　材料与方法 1.1　材料 1. 1. 1　土壤样品　水库土壤(代表天然鱼池) 荷花池土壤(代表人工鱼池) 地表0~10cm的土壤,采集后的土壤样品放在冷藏盒中, 带回实验室, 于- 20℃冰箱保存, (水库) (水库泥样) (荷花池) (荷花池泥样) 1. 1. 2　仪器及设备　实验用水浴锅, 离心机, 电泳仪 112　方法 1. 2. 1　基因组DNA 的提取　采用略加修改后化学裂解法[8 ]直接从土壤样品中提取基因组DNA。 (1) 提取缓冲液　配比为0.005mol/L 磷酸盐(pH 810) , 0.005mol/L EDTA , 0.1mol/L Tris base (pH8.0) , 1.5mol/L NaCl, 1.0% CTAB 配50ml。 (2) 土壤样品处理　将5g土壤加入13.5ml提取缓冲液和50ul, 37℃下, 225r/min 振荡30min后,加入1.5ml 20%的SDS, 65℃水浴加热2h。 (3) 基因组DNA的抽提　将上述土壤处理液以2000～ 3000r/min离心5min后收集上清液,加入1∶1的氯仿抽提上清液, 9000r/min 离心5min 后在上清液中加入1∶1的预冷的无水乙醇过夜沉淀DNA ,9000r/min 离心5 min, 用双蒸水或TE缓冲液溶解沉淀即为所得的基因组DNA粗提液。 (4)DNA 粗提液的测定　粗提液进行琼脂糖电泳检测其量. 1. 2. 2　基因组DNA的纯化　采用DNA胶回收试剂盒 , 按照操作说明对DNA粗提液进行纯化。 1. 2. 3　基因组DNA的PCR扩增　(1) 16S rRNA基因V3区的扩增　将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板, 使用PCR仪进行扩增.多数细菌和古细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对[9 ]F357GC和R518,它们的序列分别为: F357 GC, (5′- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG G