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PCR技术的原理、操作及应用 湖南省疾病预防控制中心微生物检验科 黄一伟 什么是PCR PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 PCR技术的发展历史 关于PCR 的文章首次由美国科学家 Kary Mullis等人在 《Science》杂志上发表 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。 PCR技术的原理 1 遗传物质： 细胞核? 染色体? DNA（脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成) 碱基（A、T、C、G）是按双链螺旋排列的，碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。 比如人类体细胞中共有31亿个碱基对，按上述的0.1%的差，人和人之间有3百万个碱基对的差别。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。 PCR技术的原理 2 PCR反应的基本成分 包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子 基本反应步骤 ：变性--退火--延伸 最后通过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出 PCR技术的原理 3 RT-PCR的原理 相对于PCR，在开始阶段增加步骤：RNA ? cDNA合成，是单链到双链的过程。 实时荧光定量PCR的原理 1 实时荧光定量PCR技术 (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR的原理 2 基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。 光阈值threshold的设定 一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 实时荧光定量PCR的原理 3 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 PCR技术的优点 优点: 特异 敏感 快速、 简便 易自动化等 PCR技术的局限性 为了构建特定引物，使特定DNA序列的选择性扩增，必须有一个庞大的已知序列的数据库。 聚合酶链反应效率差异很大，根据不同的因素需要优化反应条件。 PCR技术扩增产物的长度有限。 PCR技术的注意事项 防止污染，建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生，特别注意阳性样品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并经常更换，永远在最后一步才加核酸，液体分装使用等。 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高，大约1/100对碱基/20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性，升降温速率，管子的密合度等 RT-PCR注意防止RNA降解 PCR技术的操作 1 以流感病毒的RT-PCR和Real-time RT-PCR检测为例说明PCR技术的操作步骤 主要仪器：PCR仪，Real-time PCR仪，微量移液器，高速冷冻离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶电泳观察仪或成像系统，生物安全柜等。 PCR技术的操作 2 1. 病毒核酸RNA提取 2. RT-PCR反应或者Real-time RT-PCR反应 3. UV紫外灯检测或者电脑上直接读取结果 流感病毒核酸提取 1 试验材料 QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit (或QIAGEN公司的QIAmp Viral RNA Mini Kit，操作类似) β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol） 70% 乙醇 无菌及DNA,RNA酶的1.5ml 离心管 10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头 可调13K微型冷冻离心机 待检流感病毒200μl 流感病毒核酸提取 2 1、取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）200ul加在1.5ml Eppendorf管中 2、依次加入350ul RLT液、3.5ulβ-巯基乙醇和70%的乙醇550ul混匀 3、将