两种显色方法在免疫组化和原位杂交技术中应用.pdfVIP

·１２８８· 临床与实验病理学杂志　ＪＣｌｉｎＥｘｐＰａｔｈｏｌ　２０１２Ｎｏｖ；２８（１１） 两种显色方法在免疫组化和原位杂交技术中应用 １ ２ ２ 肖庆邦 ，王海青 ，郭瑞珍 关键词：免疫组织化学；原位杂交；显色 记ＭＡＰＫ单克隆抗体至显色的前一步，后用配置好的ＤＡＢ 中图分类号：Ｒ４４６　　文献标志码：Ｂ 显色剂显色。ＤＡＢ室温下显色，镜下控制显色时间，充分显 文章编号：１００１－７３９９（２０１２）１１－１２８８－０２ 色后自来水冲洗终止显色，切片经过复染，脱水，透明后封片 观察。ＤＡＢ显色３～５ｍｉｎ，阳性信号呈棕黄色、颗粒状，主要 　　免疫组织化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）和原位杂交 定位于细胞质，ＭＡＰＫ在癌组织中呈强阳性表达（图１）。 （ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＳＨ）技术是科研和临床病理诊断工作 ２．２　ＩＳＨ染色和ＡＥＣ显色　按照原位杂交技术操作过程 中经常同时采用的两种技术。在国内这两种方法均是通过 标记ＭＡＰＫｍＲＮＡ到显色的前一步，后用配置好的ＡＥＣ显色 二氨基联苯氨（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎ，ＤＡＢ）进行最后显色，其阳 剂显色。ＡＥＣ显色，滴加显色试剂后放入３７℃烤箱，显微镜 性信号均显示为棕黄色颗粒。两种方法中ＩＨＣ显示的是蛋 下控制显色时间，充分显色后自来水冲洗终止显色，复染后 白水平，而ＩＳＨ显示的是分子水平，若仅根据阳性信号的颜 用水溶性的封片剂封片观察。ＡＥＣ显色较缓慢，３７℃烤箱 色进行区别，宜混淆。为了进行有效的区别，本组实验分别 中显色１０～１２ｍｉｎ，阳性信号呈红色、颗粒状，主要定位于细 采用了国内通用的ＤＡＢ显色方法和国外应用广泛的３氨９ 胞质，ＭＡＰＫｍＲＮＡ在癌组织中呈强阳性表达（图２）。 乙基咔唑（３ａｍｉｎｏ９ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ，ＡＥＣ）显色方法对上述 两种方法进行显色，效果满意，有效区分ＩＨＣ和ＩＳＨ的阳性 信号，现报道如下。 １　材料与方法 １．１　材料　选取遵义医学院附属医院病理科２００５～２００８ 年间外检存档的２０例皮肤瘢痕鳞状细胞癌（瘢痕癌）蜡块， 石蜡组织４ ｍ厚切片，每例连续切片４张，６０℃烤箱过夜。 μ 采用Ｃｍｙｃ阳性的瘢痕癌作对照。 １．２　试剂　兔抗人 ＭＡＰＫ多克隆抗体、人 ＭＡＰＫｍＲＮＡ寡 ① 核苷酸探针原位杂交试剂盒均购于武汉博士德公司；ＤＡＢ 显色试剂盒及ＡＥＣ显色试剂盒均购于福州迈新公司。 １．３　方法 １．３．１　ＩＨＣ　采用免疫组化ＳＰ法检测ＭＡＰＫ蛋白，ＤＡＢ显 色，ＤＡＢ试剂配制按ＤＡＢ说明书进行，即用０８ｍｌ双蒸水， 滴加１滴试剂Ａ（约５０ ｌ），混合均匀，再滴加 １滴试剂 Ｂ μ （约５０ ｌ），混合均匀，最后滴加１滴试剂Ｃ（约５０ ｌ），混合 μ μ 均匀，放入４℃冰箱避光保存。 １．３．２　ＩＳＨ　采用 ＩＳＨ技术检测 ＭＡＰＫｍＲＮＡ，ＡＥＣ显色， ＡＥＣ试剂配制按ＡＥＣ说明书进行，配置方法和过程同ＤＡＢ 试剂。 ② 图１　ＤＡＢ显色，癌组织ＭＡＰＫ阳性信号呈棕黄色，ＳＰ法 ２　结果 图２　ＡＥＣ显色，癌组织ＭＡＰＫｍＲＮＡ阳性信号呈红色，ＩＳＨ ２．１　ＩＨＣ和ＤＡＢ显色　按照免疫组化染色操作过程，标 ３　讨论 收稿日期：２０１２－０９－１４ 基金项目：贵州省攻关项目（２０１０３０８０） 　　ＩＨＣ和ＩＳＨ两种技术均需通过显色剂显色，使终产物形