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实验三 叶绿体的分离、提取、观察2011.03.23 班级： 姓名： 一．试验目的 学习使用差速离心方法分离获取叶绿体。 理解叶绿体的分离与保存环境。 叶绿体的形态观察、测量、叶绿体悬液的荧光现象观察。 二．实验原理 叶绿体是植物叶肉细胞内重要的细胞器，是植物光合作用的场所。分离提取得到的活体叶绿体，既能进行光合作用速率测定，也能进行叶绿体色素的分离提取。 差速离心法常用于获取细胞中的某一物质，其原理是在一定转速条件下，不同密度大小的物质沉降速度不一样，最终使有密度差异的物质得以分离。 三．实验用具 材料与试剂：菠菜叶、0.35mol/L NaCL、95%乙醇、石英砂。 器具：离心机、天平、量筒、研钵、玻棒、纱布等 四．实验步骤 1．选用生长健壮的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0—4 ℃冰箱或冰瓶中预冷。 2．取叶片经滤纸吸干水后，称取5g剪成碎片，于10—15 mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。 3．研磨后将匀浆用2层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。 4．将滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1200r/min离心2min，弃去沉淀。 5．上清液再经3000 r/min离心 5 min ，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。 6．沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，备用。 7．用滴管取少量悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去多余的溶液，置显微镜下镜检观察。可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。 8．称取叶片5g剪成碎片，加10—15 mL95%乙醇及少量石英砂，于研钵中快速研磨，然后2层纱布过滤，取滤液，将其装入离心管，以2500r/min离心3min，收集上清液于试管中。 9．叶绿体荧光现象的观察：用强的柱状光源照射盛装叶绿素提取液的试管，然后顺着光源方向观察提取液颜色，并和对着光管观察是的情况进行比较。 五．实验结论与思考 两次离心的沉淀物颜色有什么不同？过滤的滤渣和第一次离心弃去的沉淀有那些主要成分？ 0.35mol/L NaCL溶液的作用是什么？能否将其用蒸馏水代替？ 实验用品冷冻以及实验操作在冰浴中进行的目的是什么？ 离心机使用注意事项： （1）离心管必须等量、对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。 （2）启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。 （3）电动离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。 （4）分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。 背景知识： 组织细胞的破碎方法很多，有破碎技术中细胞破碎法包括?机械法（研磨法、匀浆法、胶体磨法）和非机械法（超声波法、有机溶法、溶胀法、酶解法）。除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。 有些分离方法使用了剧烈的匀浆技术，例如通过研磨破坏细胞壁让叶绿体释放到溶液中，然后通过差速离心分离叶绿体。也可用纤维素酶或果胶酶水解细胞壁获得原生质体，再用温和的方法破坏细胞质膜，然后通过离心分离叶绿体。 用剧烈方法分离的叶绿体能够在光诱导下产生氧、ATP、NADPH、但是不能固定CO2。在电子显微镜下观察这种有缺陷的叶绿体，发现它含有很少或者根本没有叶绿体基质，并且叶绿体外被是破损的或者没有外被,将这种叶绿体称为Ⅱ型叶绿体。相比之下，用温和方法分离的叶绿体具有完整的被膜，将它称为Ⅰ型叶绿体，它能够完成整个光合作用，包括CO2的固定。 可以用Ⅰ型或Ⅱ型叶绿体作为分离叶绿体各组分的出发材料，常用Ⅰ型叶绿体分离叶绿体的亚组分。将叶绿体悬浮在低渗溶液中，破裂外被，接着用等密度离心分离叶绿体基质、外被、类囊体。如果用Ⅱ型叶绿体作为分离叶绿体亚组分的出发材料，需要弗氏细胞压碎器(French pressure cell), 分离到组成叶绿体的亚组分之后，便可对这些组分化学组成和功能进行分析。实验流程见图8E-1。 图 叶绿体各组分的分离 用温和匀浆技术分离Ⅰ型叶绿体,这种类型的叶绿体保留完整的被膜。然后在低渗条件下破坏叶绿体,使叶绿体的膜、叶绿体基质、类囊体相互分开。 叶绿素的荧光现象：指叶绿素在透射光下为绿色，而在反射光下为红色的现象，这红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。叶绿素分子吸收光量子得到能量后，从基态（低能态）跃迁到