测定双酚A增强化学发光酶免疫分析法研究.pdfVIP

第四届全国环境化学学术大会论文集(上册) 测定双酚A的增强化学发光酶免疫分析法研究串 庄惠生王书皓 (东华大学环境科学与工程学院， 上海， 201620) 摘要 本文将免疫分析和化学发光分析结合，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体为探针，四苯硼钠增强的鲁米 诺一过氧化氢化学发光体系为基础，建立了增强化学发光酶免疫分析法测定双酚A的新方法。在25’1000ng．mL-l 范围内，双酚A的浓度与化学发光强度呈良好的线性关系，检测限为6．0ng．mL一1。并应用于水样中双酚A的测 定，结果满意． 关键词 增强化学发光；免疫分析；双酚A 0引言 双酚A为一种环境内分泌干扰物，其进入动物或人体后能对机体内正常的内分泌物质的合 成、释放、运转、代谢以及结合等产生干扰作用，从而破坏内分泌系统的调控作用。研究其快速、 灵敏的分析方法测定具有重要的科学意义。 目前测定BPA的方法有HPLC法【1】、荧光光度法【2】、酶联免疫分析法(ELISA)【3】、极谱法 [4】等。普通的光度分析方法提供了简单的操作，但选择性较低；色谱分析方法灵敏度高，但仪 器昂贵、操作麻烦；免疫分析由于具有灵敏度高、特异性好的特点，已受到人们的青睐。 化学发光分析灵敏度高、线性范围宽、设备简单，是一种应用极其广泛的检测方法。将化学 发光分析与免疫分析技术结合而形成的化学发光免疫分析具有更广泛的应用前景。本文以辣根过 氧化物酶标记羊抗兔抗体为探针，四苯硼钠增强的辣根过氧化物酶催化鲁米诺一过氧化氢发光混 合液作为发光体系，建立了增强化学发光酶免疫分析法测定双酚A的新方法，并将其应用于血 清中双酚A的测定，取得了满意的结果。 1测定方法 于平底聚苯乙烯透明小试管中，加入浓度为40u g／mE包被原(自制)的pH9．6的包被液 300laL，4℃，包被过夜；然后洗涤3次，甩干。加400ItL0．2％卵清蛋白封闭液，37℃，封闭 1．t lh后洗涤3次，甩干。配制BPA标准溶液：取lmgBPA，加乙醇稀释到50mL，得20g／mL的 pL于5 1．t 上述溶液各400L加到平底聚苯乙烯透明小试管中，37℃，温育lh。洗涤3次，甩干。加400 p min。洗涤3次，甩干。再加入鲁米诺和四苯硼钠的 L酶标二抗lgG-HRP(1：1000)，37℃，30 la IIL 混合液300L，然后注入300H202，于化学发光分析仪上测定化学发光强度。 2结果与讨论 2．1分析条件的优化 文献[9】发现四苯基硼酸钠可增强Luminol—H202一HRP化学发光反应体系发光强度。本文将 该增强剂应用于免疫分析测定双酚A的研究中，实验表明适宜的试剂浓度：鲁米诺为5．0× 10．4mol／L，H202为3．0x mol／L 10．2moFL，NaTPB为2．92×10—2mol／L。反应介质为0．2pH8．6 硼酸．硼砂缓冲溶液。 ’本文得到国家自然科学基金项目和高等学校博士学科点专项科研基金(20060255004)资助 80 第四届全国环境化学学术大会论文集(I-艘／) 在选定的实验条件下，加入不同量的抗BPA抗体，绘制抗体浓度与发光强度的关系曲线， 抗BPA抗体的稀度在l：25~1：400之间与相对化学发光强度呈线性关系，本文选用l：50的抗 体。 在选定的实验条件下，加入不同稀释比的羊抗兔IgG-HRP，绘制lgG．HRP稀释比与发光强 度的关系曲线表明，】gG—HRP稀释比在l：400-I：3000之间与相对化学发光强度呈线性关系，本 文选用l：1000的酶标二抗。 归方程为AI=138．91 lgC一147，59，相关系数R2=0．9913，方法的检出限为5．0ng／mL。 2．2水样中BPA的测定