质粒DNA的提取及电泳.pptVIP

分子生物学实验 当你翻开书本的时候，你必须尽可能地展开想象的“翅膀”，否则，你就不能走在别人的前面; 而当你进入实验室时，要象脱下你的外衣那样脱下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受到影响。 实验相关知识 1、实验准备: 2、实验室安全与卫生 3、分组与实验操作 4、实验报告与成绩评定 实验一、质粒DNA的提取纯化 实验目的: 学习与掌握最常用的质粒DNA的提取与纯化方法 实验原理: 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。 DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA变性，如加热、极端PH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性 SDS是一种阴离子表面活性剂，即可使细菌裂解，又可使蛋白变性，因此用SDS处理细菌会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来。 释放出的DNA在强碱的作用下发生变性，再用酸性醋酸钾（KAc）缓冲液中和，质粒DNA迅速复性，而基因组DNA分子量太大不能复性。 离心后，质粒DNA在上清中，而基因组DNA与细胞碎片一起沉淀至离心管底部。 通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来 试剂准备 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min ，贮存于4℃。 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。0.4N NaOH，2%SDS使用前等体积混合，临时配置。 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，加ddH2O至100ml。4℃保存备用。 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 操作步骤 在50毫升的LB培养基中加入50微升氨苄青霉素（终浓度50微克/毫升），接入含PUC19的大肠杆菌，37度过夜培养。 取1ml培养物入微量离心管中，室温离心12000转×30s，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽，将10毫升菌体收集在1个小指管中。 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置15min。12000转，10分钟，将上清移到另一个小指管中。 （溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。） 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000转× 10min，将上清移到另一个小指管中。 加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，离心12000转× 10min，将上清移到另一个小指管中。 加入2倍体积预冷的无水乙醇，旋涡混匀，-20 ℃放置30min，离心12000转×10min，去上清。 1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次（每次离心12000转×5min），弃上清，将沉淀在室温下晾干。 沉淀溶于20μl TE缓冲液（超纯水）， -20℃保存备用。 实验二、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验目的：学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的构型 实验原理： 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA、线性质粒DNA和开环质粒DNA。 实验方法 选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。 选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 制备1%琼脂糖凝胶。 （0.2克琼脂糖，加20毫升0.5倍的TBE） 将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。 将DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（10