LRRC4基因通过LRR结构域抑制脑胶质瘤细胞增殖与侵袭功能的研究.pdf

摘要 LRRC4基因通过LRR结构域抑制脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的功能研究 博十研究生：武明花 导师：李梓源教授 中南大学肿瘤研究所 摘要 [LRR04基因的克隆、生物信息学特征及前期研究结果】 LRRC4基因是我室王洁如博士在鼻咽癌全基因组扫描和比较基 因组杂交分析的基础上，采用定位候选结合5-RACE技术从染色体 构(1eucine．rich repeat，LRR)，因而被人类基因组命名委员会重命名 表现出脑相对特异表达的特点，而在脑瘤组织(80％)，尤其是Jjiif胶 因功能的研究发现：LRRC4基因的重表达能够通过抑制磷酸化的 胶质母细胞瘤U251细胞阻滞在G0／G1期，抑制U251细胞的体外生 长，同时，裸鼠皮下移植瘤形成实验表明LRRC4能够明显的抑制 U251细胞的体内生长。综上所述，LRRC4基因可能是一个与脑瘤特 别是恶性胶质瘤的发生密切相关的候选抑瘤基因。 [LRR04基因在恶性胶质瘤细胞系中的表达分析】 研究表明，一个候选的肿瘤抑制基因的确定除了检测该基因在体 摘要 内、外抑制肿瘤细胞的生长作用外，还要进行细胞和分子遗传学分析 M17等六种恶性胶质瘤细胞系中表达均缺失。为了明确LRRC4基因 在恶性胶质瘤细胞系中表达缺失是否由编码区序列的突变引起，我们 进一步从这几种细胞系的基因组DNA中扩增LRRC4基因的编码区 序列并进行测序分析。结果发现，SFl26、SF767和M17三种细胞基 因组DNA中均可扩增出LRRC4基因的编码区序列，但产量明显低 于管家基因GAPDH，测序分析表明三种胶质瘤细胞串扩增出来的 LRRC4基因均在第279位氨基酸的第三位密码子发生了同义突变 质瘤细胞系中表达缺失不是基因突变所致。而U251和U87细胞基因 性缺失。因此，LRRC4基因在U25】细胞中表达缺失是由于染色体 7q32．ter的纯合性缺失所致，这同时也将LRRC4在7号染色体上的 l一32。 定位缩小到7q32末端，而不再是7q3 【LRRC4通过LRR结构域抑制1．1251细胞的体外生长】 cole LRR结构域(LRRcassette)是由核心LRRs(theLR飚)和两端 研究表明，只有作为受体、受体激酶或黏附分子的LRP(]eucine．rich 摘要 repeat 的这种结构特点表明LRRC4可能是一个受体：受体激酶或黏附分子， 参与细胞生长和侵袭的调控。本实验采用一步PCR法构建一系列缺 失突变体，转染至U251细胞，通过MTT和软琼脂集落形成实验探 发现：LRRC4抑制U251细胞的生长依赖于它的LRR结构域，而不 细胞体外生长所必需的。当第三个LRR缺失后，LRRC4不再抑制 胞生长几乎没有影响。同时，pEGFP．LRRC4野生型及突变体质粒转 位。 [LRR04通过LRR结构域调控ERK／AKT／NF-KB信号转导通路】 研究表明很多与神经系统生长发育相关的富亮氨酸重复蛋白 (Leucine-rich repeat GTPases发生相互作用而调控Ras相关的信号转导通路，调控神经细 胞的增殖与分化。ERK／MAPK是Ras依赖的信号转导通路，在胶质 K 活化的AKT可通过活化I K或直接磷酸化NF—rd3p65亚单位而激活 NF．K B调控细胞周期、细胞分化或凋亡基因的转录。Western—blot检 摘要 制剂LY294002处理转染和未转染LRRC4的U251细胞发现，LRRC4 示LRRC4抑制ERK和AKT的磷酸化表达依赖于它的LRR结构域， 位的磷酸化表达，下调细胞周期调控蛋白CyclinDl和CDK2，延缓 p27 细胞的凋亡。 【LRR04通过LRR结构域抑制U251细胞的侵袭】