基因转染技术.pptVIP

分子生物学技术在药理中的应用 基因转染技术 主要内容 一 、 概述 基因转染的定义：将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。 基因转染技术：将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。 基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。 基因转染方法 二 、 基因运载系统 （一）非病毒方法 准备DNA: 构建?提质粒?线性化? 准备细胞：0.5～1×107 将细胞、DNA加入电极杯 冰上预冷（！） 设置电脉冲参数?电击 常温静置 转移细胞至培养皿 24－36小时后加筛选药物 美國Bio-Rad公司PDS-1000型/He基因槍 三、转染的基本过程 5. 各种转染方法比较 5. 各种转染方法比较 、 被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。 （一）靶细胞的准备 、 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其它化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。DNA的质量和纯度能影响某些细胞系的转染效率，可以通过CsCl梯度法或标准柱层析法进行纯化。 （二）靶基因质粒DNA的准备 、 具体的基因转染条件应参考所使用的试剂和方法进行优化。靶基因被导入细胞后，一般在转染后24小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin ） （三）转染与分析 、  在目前的技术状态下，基因转染效率很难达到100﹪。故必须首先将转导细胞和未转导的细胞加以区分。这样的新技术发展很快，常用的转导细胞筛选方法： 1.利用基因表达产物筛选法 （1） 标记基因筛选法 在载体上引入一个标记基因，或同时导入标记基因，在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛选标记基因表型，那些已导入外源基因的细胞将存活下来。 、 （2） 基因缺陷型受体细胞的选择性 以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选择性培养基进行筛选。 （3） 基因共转染技术 将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后得到复合转导的转化子。 、  2.分子生物学方法 外源基因是否真的转入靶细胞必须用分子杂交方法进行证实。常用的方法有原位杂交、Southern杂交。其中主要问题是探针的选择。 、  在筛选出转化子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因的鉴定。常用方法有原位杂交、Northern杂交、免疫组织化学染色等，原位及Northern杂交是检测外源基因转录出的mRNA,后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。 四、外源基因的表达和检测 、  1 、用于建造疾病的动物模型和药物筛选模型 2 、用于基因治疗 3 、用于异种器官移植 4 、用于改良动植物品种和生产性能 5 、用于生产药用蛋白和保健蛋白 6 、用于生产人抗体 五、主要应用 为最新一代的转染试剂，具有操作简单；稳定性好；转染效率高，细胞毒性低的特点；通过调节聚合物/DNA比例优化实验。 稳定转染 瞬时性转染 阳离子聚合物与核酸等形成稳定的复合物被细胞内吞 阳离子聚合物 适用细胞广；转染效率高，重复性好但转染时需除血清和抗生素；相对具有一定毒性 稳定转染 瞬时性转染 带正电的脂质体和核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。 阳离子脂质体法 操作相对简单；但需高浓度DNA ；DEAE葡聚糖浓度 ；温育时间 瞬时表达 抑制核酸酶 内吞作用 DEAE葡聚糖转染法 不适用于原代细胞； 操作较简便但重复性差 细胞毒性较大；效率较低 稳定转染 瞬时性转染 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。 磷酸钙法 可用于难转染的细胞；但携带基因不能太大；需考虑安全因素 稳定转染 瞬时转染 特定宿主细胞 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 病毒