人免疫球蛋白G非酶糖基化修饰作用研究.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2008)论文集 C19人免疫球蛋白G的非酶糖基化修饰作用研究 彭博李浮庆宏邓玉林半 北京理工大学生命科学与技术学院，北京100081 蛋白质的非酶糖基化，又称Maillard反应，是一个{}常复杂的多步骤反应，有多种不同的 途径及中间产物，在机体内是由蛋白质的氨基和还原糖的羧基经过缩合、重排、裂解、氧化 修饰后产生一组稳定的晚期糖基化终末产物(Advancedend glycationproducts，AGEs)，并进一 步与其他蛋向质、核酸大分子物质以及脂类形成巨交联物。糖基化影响蛋自舶结构和功能， 最终引发一系列生物学效应。衰老、糖尿病并发症、某些构象病以及神经退行性疾病等都与 蛋白质的非酶糖基化有密切关系。 ， 本文以人血浆中的高丰度蛋白之一——免疫球蛋白G为研究对象，在体外模拟蛋白的化 学糖化反应，通过液相色谱一质谱联用的方法比较反应前后的肽段差异，检出了一组易发生糖 基化修饰的典型肽段，为进一步筛选血浆蛋白中的肽类生物标志物提供了重要依据，对糖尿 病、老龄化等与AGEs相关疾病的早期临床诊断有着良好的前景和重要意义。一 1实验部分 1．I仪器与试剂 人IgG、尿素、肼‘、碳酸氢铵购自美国Sigma公司；甲酸购自美国Dikma公司：测序 级胰蛋白酶购自美国Promega公司；乙腈为色谱纯，购自美国Fisher公司。其他试剂均为分 l 6210飞行时间质 析纯。主要仪器为Agilent100系列高效液相色谱串联离子阱质谱和Agilent 谱。 1．2样品制备与预处理 PBS缓冲液(pH=7，20)qa，IgG 将人IgG与不周浓度的葡萄糖进行体外共育培养。在0，01M 葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照。经O．29in无菌滤膜过滤除菌后，避光静置于37。C恒温 水浴中共育培养，培养时问分别为0天，10天，20天和30天。 8．0M 反瘟后将样品真空冷冻干燥，进行胰蛋白酶消化。每0．2mg蛋白样品中加入lOOpJ 100raM 100mM IAM，置暗处反应lh；然后加 尿素和．109l DTT，37C水浴4h；再加入5％1 50ram Trypsin，37。C水浴过夜：酶切完成后加10％TFA终止反应。 900pI NH4HCO，和499 ACN AccuBondSPEODS．C18柱，先以2ml 质谱检测前对酶切后的肽段脱盐。使用Agilent 活化，再加3ml O．1％TFA平衡柱子，然后加入含有0．6mg肽段的样品溶液充分浸透柱子后， 0．1％TFA冲洗脱盐，最后以1．5ml70％ACN／0．1％TFA洗脱肽段。将收集的肽段溶液真 用3ml ’空冷冻干燥后用初始流动相溶解。 1．3LC—MS检测条件及数据处理方法 色谱条件：固定相：SHISEIDOC18反向色谱柱，4．6mmi．d．x150mm，59in，300A：流动 95％A-60％A，60·65rain60％A一0％A， 相：0．1％甲酸水溶液(A)一O．1，％甲酸乙腈溶液(B)，0-60rain 65．70rain0％A．95％A；流速：0．8ml／min；进样量：409l。 质谱条件：电离源：电喷雾(ESI)；离子化方式：正离子模式；接口参数：雾化气：30ps