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Slug-siRNA转染对胰腺癌细胞生长的影响 崔海宁 张克君* 吴幸 王正文 海南医学院附属医院 普外科 517001 [摘要] 目的 研究Slug基因沉默后对体内胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响 方法 构建靶向抑制Slug的siRNA表达载体，瞬时转染CaPan-2细胞。免疫组织化学、RT-PCR和Western blot法检测细胞Slug表达的变化，MTT检测细胞增殖，Annexin V-FITC/PI、Hoechst33258和PI双染色染色了解细胞凋亡的变化。结果：成功构建了pGenesil-1-Slug-siRNA(pSlug-siRNA)和pGenesil-1-Neg-siRNA (pNeg-siRNA)表达质粒；质粒瞬时转染胰腺癌CaPan-2细胞72h后，细胞内Slug表达受到明显抑制。Slug-siRNA细胞的生长受到抑制，并且细胞凋亡率明显增加 结论：Slug-siRNA抑制Slug表达后可以在体外促进CaPan-2细胞凋亡并抑制细胞的增殖。 关键词： Slug;小干扰RNA;瞬时转染;增殖;凋亡；胰腺肿瘤；CaPan-2 Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因Austin,USA、感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术公司、限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4连接酶为Promega公司产品、LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品、四甲基偶氮唑蓝(MTT)为sigma公司产品、BCA蛋白浓度测定试剂盒及敏感曝光试剂盒为Pierce公司产品；Slug多克隆抗体及G3PDH抗体为Santa Cruz公司产品、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗为北京中山公司产品。凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司;siRNA的转录模板由上海生工合成，合成的序列分别为Slug-siRNA (GenBank accession no. AK223368, 目的片段作用于Slug编码区的523-541位，下划线表示19bp) sense: ?5-GATCCGACTACAGTCCAAGCTTTCTTCAAGACGTTGATGTCAGGTTCGAAAGTTTTTGAATTCA-3antisense: 3-CTAGGCTGATGTCCAGGTTCGAAAGAAGTTCTGCAACTACAGTCCAAGCTTTCAAAAACTTAAGT-5;Negative-siRNA:( 与人类编码基因序列无同源性的碱基序列,使用BLAST方法排除):sense:?5-GATCCCAGACTTGAAACCCGTTTcTTCAAGACGcTAGTgTCGGATTAAACGGTTTTTGAATTCA-3;antisense:3-GATAGGTTGGACTTGTTTCTAAGTTCTGCACATCCCATGGGCAATTTGAAAAACAGCTGTGCGA-5; 2 质粒的构建：合成的siRNA转录模板长度为64bp,在序列中间为加入9个茎环序列分隔的正反向靶序列，尾端插入5个TTTTT作为终止序列，上游和下游分别加了BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，pGenesil-1质粒经BamHⅠ、HindⅢ酶切后与合成的表达模板DNA片段用T4DNA连接酶连接（16O°C，8h) ,转化DH5α菌株,涂卡那霉素琼脂平板,挑选阳性克隆,扩增并提取质粒,用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆送上海英骏生物公司测序,测序正确后大量提取质粒. 方法 1细胞培养：胰腺癌细胞CaPan-2购自中科院上海细胞所）激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。96孔培养板，104细胞/孔,每孔加入200μl含10％FBS的高糖DMEM液，分别培养0,12,24,36,48,72h，每组设3个复孔。在每个时间点加入5mg/ml的MTT液（20μl/孔）,继续培养4h，培养条件同上。吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150μl／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪检测各孔A570值，绘制连续5d的细胞生长曲线。实验重复3次，结果用x±s表示。 5 Hoechst33258和PI染色: Hoechst 33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，PI可以染色坏死细胞。上述两种染料双染后，使用荧光显微镜观察，正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光＋强蓝色荧光。三组细胞接种于6孔板中，72h取出玻片，用1×PBS洗一次。加入细胞染色