乳酸菌天然质粒提取方法的优化.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（２）：９４９９ 乳酸菌天然质粒提取方法的优化 １ １，２ １ １ １ １ 万　谦 　曹　健 　吴兴泉 　李艳芳 　李凤娟 　宋　鹏 （１河南工业大学生物工程学院　郑州　４５０００１　２中原工学院　郑州　４５０００７） 摘要　将前人报道的乳酸菌质粒提取方法与大肠杆菌质粒提取方法相结合，对常用试剂盒质粒 提取方法进行改进，建立了一种快速、安全、高效的乳酸菌质粒提取方法。提取过程中，溶菌酶最 佳浓度为２０ｍｇ／ｍｌ，最佳处理时间为３０ｍｉｎ，同时避免了毒性物质溴化乙锭的使用。多次实验结 果表明，采用改进后的方法可明显提高乳酸菌天然质粒的提取效果。且重复性好，为下一步乳酸 菌的分子改良奠定了基础。 关键词　乳酸菌　天然质粒提取　方法优化 中图分类号　Ｑ８１９ 　　乳酸菌（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ，ＬＡＢ）大多是益生菌， 时，需要有一个简便的方法来判断菌体中是否已含有 是目前研究较多的一类工程菌株。随着研究的深入， 质粒。乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞壁比较厚，肽聚糖 人们发现乳酸菌许多重要代谢功能的不稳定性和易缺 含量较高，交联程度大，细胞裂解有一定困难。且质粒 ［１］ 大小差异较大，大质粒在提取过程中易断裂，拷贝数 失现象都直接或间接地与其携带的质粒有关 ，从而 激发了人们对乳酸菌染色体外遗传物质———质粒的研 低，所以一般的质粒提取方法不是很有效［１０］。１９８３ 究。近十多年来，随着乳酸菌内源质粒基因序列的测 ［１１］ 年，Ａｎｄｅｒｓｏｎ等 提出了一种适用于提取乳酸乳球菌 定、电穿孔技术的建立，以及乳酸菌中表达信号的分离 大小质粒的方法，通过采用合适的生长和裂解条件，并 和克隆，已建立和发展了一系列具有不同用途的乳酸 将碱变性和热变性结合使用，取得了较好的效果。 ［２３］ ［１２］ 菌载体和受体系统 。食品工业中广泛使用的乳酸 １９９３年，Ｄａｎｉｅｌ 提出了提取乳酸菌质粒的一般方法， 菌、酵母等一般被认为是安全的（ｇｅｎｅｒａｌｌｙｒｅｇａｒｄｅｄａｓ 并发现乳杆菌在质粒组成上差异较大，许多菌株无质 ［４］ 粒或很少有质粒。本文研究的目的，是通过将已报道 ｓａｆｅ，ＧＲＡＳ） ，因而，研究与开发乳酸菌食品级载体 受体系统，探索重要基因在乳酸菌中的克隆表达已成 的Ｄａｎｉｅｌ等建立的乳酸菌质粒提取方法与大肠杆菌质 为乳酸菌分子生物学研究的重要内容之一，对于食品 粒提取方法相结合，并进一步改进常用试剂盒提取质 与发酵工业都将起到重要的推动作用。食品级基因表 粒的方法，建立一种快速有效的乳酸菌质粒提取方法， 达载体和受体系统的研究已成为近年来该领域研究的 为下一步乳酸菌质粒的分子研究以及食品级表达载体 ［５７］ 的构建奠定基础。 前沿和热点 。 　　可用于乳酸菌质粒表达的宿主菌主要有粪肠球菌 １　材料与方法 （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉ）、植 物 乳 杆 菌 （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｎ）、乳酸乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）、嗜酸乳杆菌 １．１　菌　株 ［８］ 　　 嗜酸乳杆菌 （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＧＭＣＣ （Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）等 。在实验中，要验证表达 载体是否已转入宿主