PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法.docVIP

PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法 ? ? ? 1. B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。 ? 2. 准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。 ? 3. 取4周后未抽台前的叶片，约90片。切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。 ? 4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。 ? 5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。 ? 6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。 ? 7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。 ? 8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。 ? 9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。） ? 10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。 ? 11.