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高效液相色谱使用方法 流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 2487紫外检测器的使用 打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 设置检测波长 预热30分钟左右，即可注样测定。 试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱 0～4℃ 冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干 至瓶中液体结冰 ，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。 μm滤膜。若样品色素较多，需通过C18小柱进行脱色，然后再过滤。 C18小柱使用方法： C18柱：甲醇（5ml）-----乙醚（5ml）-------80%乙醇（5ml）-----样品--------80%乙醇（样品量的二倍）------乙醚-------80%乙醇-----样品--------80%乙醇 五、HPLC测定 测定方法及色谱条件为：Water 600E高效液相色谱，碳水化合物柱，柱温30-35℃，2410示差检测器，流动相比例为75％乙腈：25％超纯水，流速为1.0ml min-1,Water Millennium软件控制及数据处理。 试验六：蔗糖代谢酶的测定 一、试剂的配置（先溶解、快到1升时调PH值） 1、50m M HePes—NaOH PH7.5 缓冲液体系配置 1升 50 m M HePes：11.9150g NaCl:16.0 g kCl::0.74 Na2HPO4.12H2O:0.543 葡萄糖：2 1m M EDTA:0.3722 10 m M MgCl:2.0330 2.5 m M DTT :0.3856 10 m M Vc 1.7614 2 、PVPP:固体 3、0.1M NaHPO4-柠檬酸（PH4.8） 0.2M NaHPO4（35.8/500ml 9.86ml ） 0.1M柠檬酸 21.01g/L 10.14ml 4、0.1M NaHPO4-柠檬酸 PH：7.2 0.2M NaHPO4 17.39 ml 0.1M柠檬酸 2.61 ml 5、0.1M蔗糖：3.4229g定容至100 ml 6、2N NaOH:8g NaOH定容至100 ml 7、30%HCl:39.5ml浓HCL加入到10.5 ml 水中