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肾癌G250抗原蛋白多糖（PG）区蛋白cDNA的克隆和序列测定_医学论文 肾癌G250抗原蛋白多糖（PG）区蛋白cDNA的克隆和序列测定_医学论文 作者：郑典宝，郑骏年，郝林，武艺，刘俊杰，裴东生，胡书群，陈家存，孙晓青 【关键词】 序列分析 　　摘要 :目的 克隆肾癌G250抗原蛋白多糖（PG）区cDNA，为制备G250杂交瘤及抗G250的单克隆抗体奠定基础。 方法 从肾癌细胞786-0中提取总RNA，以RT-PCR方法扩增出全长360bp的G250抗原PG区cDNA，将其与表达载体pCA13连接，转化大肠杆菌JM109，构建G250抗原PG区cDNA克隆。 结果 酶切及序列分析表明，与GenBank报道的G250抗原PG区cDNA序列完全一致。 结论 G250抗原PG区cDNA已成功地得到克隆。 　　关键词 :G250抗原PG区蛋白cDNA克隆序列分析 　　（Department of Urology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China）Abstract:Objective To obtain the cDNA of proteoglycan（PG）region protein of G250antigen to get ready for preparing the hybridoma and monoclonal antibody of G250antigen.Methods The total RNA was extracted from human renal carcinoma cell line786-0and the intact cDNA of PG region protein was amplified by RT-PCR.The cDNA was cloned into pCA13vec-tor and transformed into E.coli JM109.Results The sequence determined was completely consistentwith the published PG re-gion protein cDNA.Conclusion PG region protein cDNA has been cloned successfully. 　　Key words:G250antigenproteoglycan（PG）proteincDNA cloningDNA sequencing 　　肾癌（RCC）占肾恶性肿瘤的85%以上，居泌尿系肿瘤第2位，其中90%为透明细胞癌。肾癌位置隐蔽，早期不易发现，虽然近年来影像技术发展迅速，但早期诊断仍很困难。同时，肾癌恶性度极高且对放、化疗均不敏感。因此，临床上期待出现能早期诊断肾癌和治疗效果更好的新技术。1986年，荷兰科学家Oosterwijk［1］发现了一种新的肾癌相关抗原G250并对其进行了系统、深入的研究，发现G250抗原具有良好的肾癌特异性。G250单克隆抗体介导的肾癌早期诊断及生物治疗已应用于临床且取得一定疗效。本实验克隆出G250抗原PG区蛋白cD-NA，并进行了序列测定，为制备G250杂交瘤及抗G250单克隆抗体奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 主要材料 总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、核酸限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ以及T4DNA连接酶均购自Promega公司人肾癌透明细胞株786-0、E.coli菌株JM109和质粒pCA13为本室保存。 　　1.2 总RNA提取 取786-0细胞1×10 5 ，按试剂盒说明提取总RNA。总RNA沉淀溶于100μl无核酸酶的水中，-80℃保存。 　　1.3 引物的设计与合成 根据发表的人肾癌G250抗原cDNA序列，设计PCR引物。上游引物:5′-ATCCCCAAGCTTGCCCCCGGATGCAGGAG-3′，引入了1个HindⅢ酶切位点。下游引物:5′-CCAC-CGCTCGAGTGAAGCGGCCCGCGCAG-3′，引入了1个XhoⅠ酶切位点（加下划线处为酶切位点）。引物由Invitrogen公司合成。 　　1.4 RT-PCR 加入总RNA20μg作为模板，上、下游引物至终浓度1μmol.L，用Promega公司的RT-PCR系统进行反转录及PCR扩增。反应条件为:94℃30s，60℃1min，68℃2min，40个循环。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。 　　1.5 cDNA的克隆及扩增 PCR扩增产物经酚-氯仿抽提纯化，HindⅢ和XhoⅠ双酶切及