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分光光度计的基本原理 姓名：陈凯 专业：生物科学 学号：2012040216 分光光度计的基本原理 分光光度计主要用于反射和透射测量。 分三种光源：S偏振光、P偏振光和自然光。 现有设备7台（2台日立U4100、1台JACSO-V650、1台JACSO-V570、2台KT1100、1台瞬间7700）主要由是由分光光度计和电脑组成，由电脑程序驱动。 一·分光光度计的组成 各种型号的可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。 1.光源 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源。热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。 2.单色器 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。 3.吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。吸收池的种类很多，其光径可在0.1～10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。 4.检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。 5.信号指示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等 二.分光光度计光谱范围 包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200～400 nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.氢灯（或氘灯）的发射光谱:氢灯能发出185～400 nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源.物质的吸收光谱(1)如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱. 不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.物质的吸收光谱(2)当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液. 入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光 如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为空白去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则: 入射光 = 吸收光 十 透过光 三.原理及测试方法 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。 单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式： A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc 式中 :A 为吸光度； ??基本原理 I。为入射的单色光强度； I 为透射的单色光强度； T 为物质的透射率； k 为摩尔吸收系数； L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长 c 为物质的浓度 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。C C未A未A 标准工作曲线图λmaxA λ 4 剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万； ③选择性好： 目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法； ④准确度高： 对于一般的分光光度法，其浓度测定的相对误差在1～3%范围内，如采用示差分光光度法进行测定，则误差可减少到0.X%； ④适用浓度范围广 可从常量（1%～50%）到痕