基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动.docVIP

基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。 一．真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件： ⑴ 载体能够独立复制，具有复制起点。 ⑵ 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因 的克隆鉴定和筛选。 ⑶ 应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。 ⑷ 应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行 转录。 ⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA 较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列， 以便转录后顺利翻译。 二．影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素： 5’-UTR对克隆基因表达效率的影响 a. 启动子结构对表达效率的影响 大肠杆菌启动子的保守序－35区（5’TTGACA）和－10(5’TATAAT)区；它们之间的距离(17bp)。 b. 启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 当mRNA分子5’-末端与SD序列之间的长度小于15bp时，转译效率下降。 2.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响 a. 转译起始序列对表达效率的影响 SD序列后面的4个碱基，T或A时转译作用较高，C或G时， 下降50%或25%；位于起始密码子AUG上游的密码三联体的 碱基，CUU或UAU时转译效率最有效，UUC、UCA或AGG 时下降20倍； 位于起始密码子AUG下游的密码子碱基组成，也影响转译 的速率。 b. mRNA的稳定性对表达效率的影响 3.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 a. 密码子使用的偏爱性现象的规律性 ( 几乎在所有的简并密码子家族中，都有一个或两个是优先 使用的偏爱性密码子； ( 一些密码子在各种不同基因中都是最常用的（在编码脯 氨酸4种同义密码子，CCC是优先使用的） ( 高表达活性的基因比低表达活性的基因，呈现出较高程 度的密码子偏爱性 简并密码子的使用频率，反应它们相应的tRNA丰度。 b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因，很难在大肠 杆菌转化子细胞中得到有效的表达。 不同生物密码子的偏爱性，是阻碍外源基因在大肠杆菌 中高效表达的一种重要因素。 4.质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响 a. 质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响 b. 质粒载体的不稳定性对表达效率的影响 5. 寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 培养基营养成分的选择、细胞培养方式、培养 温度等环境因素能影响大肠杆菌生理状态。 质粒拷贝数 质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。 三．减少形成包涵体的策略： 降低重组菌的生长温度。 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂（高浓度多醇类、蔗糖）。 供给丰富的培养基，创造最佳培养基（供氧、pH等） 四．酿酒酵母表达系统 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌；且发酵过程中产生乙醇。 乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。 1、毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因 此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达 2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不 易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中， 能够筛选到高表达菌株 3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动 子特别适用于外源基因的调控表达 巴斯德毕赤酵母表达系统