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犬细小病毒核酸疫苗及其实验免疫研究 邱薇1范泉水1李作生1李丽红1 杨美峰1郑颖1王双印1夏咸柱2 1成都军区联勤部军事医学研究所 2军事医学科学院军事兽医研究所 细小病毒，病毒粒子小，无囊膜，属单链DNA病毒。CPV属猫细小病毒亚群，感染犬．在幼龄 犬中引起严重的肠炎，在新生幼犬中引起心肌炎。CPV和猫泛白细胞减少瘟病毒(矸，、r)的 棱农壳蛋白的氨基酸序列有98％的同源性，由于高度的同源性和近年来犬病的严重流行。 CPV被认为是FFV的一个新宿主变异株”。CPV核衣壳基因编码两个重叠蛋白VPl和VP2， VP2是主要的核衣亢蛋白。从vPl开放阅读框架的一个框架内ATG编码子开始翻译。vP3 是完整的VF2核衣壳氨基末端除去1㈣个氨基酸形成的。VPI约占CPV核衣壳蛋白的 10％。其余90％由VP2和VF3组成。表位图谱试验表明结合中和抗体的全部抗原决定基都 在VP2中，VPI特有区域中还发现二个T一细胞表位。VPI约，÷CPV核衣壳蛋白的10％。 其余90％由VP2和VlW3组成。表位图谱试验表明结合中和抗体的全部抗原决定基都在 vP2中．VPl特有区域中还发现一个T一细胞表位…。 的编码基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，通 过宿主细胞的转录系统，使外源基因在活体内表达。产生的抗原激活机体的免疫系统，诱导 宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答。从而达到预防和治疗疾病的目的。NAVs诱导体 液和细胞免疫，不复制，不感染宿主，易于生产以及在室温下长期稳定，还提高了毒株间的 交义保护且保持病毒抗原的大然形式”l。这些性质使NAV比常规疫苗和重组疫苗更优越， 具有控制人和动物传染性疾病的潜力。核酸疫苗已实验性地用于鼠，以抗各种病毒和人的 肿瘤相关抗原，包括：流感病毒、人I型免疫缺陷病毒、狂犬病病毒、人类乙型肝炎病毒，牛疱 疹病毒l、人癌胚抗原以及淋巴细胞性赫络丛脑膜炎病毒。 传统的灭活和致弱的活病毒(MLV)CPV疫苗含整个病毒粒子，这两种疫苗有较人的免 疫原性，新一代MLVCPV疫苗克服了部分母源抗体问题，小剂量疫苗就可产生更高效的免 疫…，。研究其它CPV疫苗的还有：利用杆状病毒表达系统的重组疫苗和合成肽疫苗”，这些 疫替与佐剂一起按种犬后，可诱导抗CPV的免疫保护。但NAV有避免应用有毒佐剂的优 点。另外，重组疫曲只激发一次免疫反应，需多次接种才能获得保护，而NAV可持续表达 CPV病毒抗原，可产生比重织疫曲更好的免疫反应。合成肽疫苗局限于限制了抗原的表 位，而CPV的NAV表达天然、完整的病毒抗原蛋白．能更好地刺激免疫系统。本研究用夫 较高的免疫反应，使其能够抵抗强毒的攻市，现报告如下。 l材料与方法 1．1试剂、细胞株及动物限制性核酸内切酶BaraH工、Notl及％DNA连接酶购白人连宝 生物公司。plRES载体由本实验室保存。DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公 195 司。人肠杆凶脚感受态细胞由本实验室制备。猫肾(鹳1)细胞、cPV毒种由本实验室保 存。6只混合饲养的CPV(bl‘凝抑制效价≤2的昆明犬为市售。 1．2引物根据文献合成一对引物，上游引物中含B—m限制位点，一h游引物中含NotI 限制付点。引物由上海生工合成。引物序列如下：N5，--CC,C,GATCCGAGAC． GACTrGGATrAAGGTA--3，：P25一IGl6sG(赵坦：T^GrIB^T^彻A^_I!A^^C一3。 1．3 CPV病毒DNA的制备用从感染犬粪便中提取的CPV一2b型病毒接种猫肾(F91)细 胞，收集上清液，浓缩，用苯酚：氯仿(1：1)抽提5次，乙醇沉淀DNA，溶解于lOmMTm(PH8。 0)眦DTA溶液中，于一20c冻存。 1．4目的基因的PcR扩增与回收以CPVDNA作为模板，用Pl片段引物进行PcR扩增。 60s， 50C 90s，了2。C120s循环5次，然后95C608，550(290B，72c120s再循环35次，产物在0．8％ 琼脂糖凝胶上进行电泳，并用胶回收试剂盒回收2．2kb的目的片段。 1．5Ⅷ片段的克隆和序列测定分别用NotI和Bamll