上海伯豪DNase I footprinting assay.doc

上海伯豪DNase I footprinting assay服务说明 技术背景 DNase I足迹分析实验是一项用来研究DNA与蛋白质相互作用的实验技术。常见的研究DNA与蛋白相互结合的实验有三种：DNase I足迹分析实验、EMSA、ChIP。 EMSA：凝胶阻滞实验，又称Gel Shift。是一种体外检测蛋白与DNA是否结合的实验。实验原理为：倘若DNA与蛋白相互结合了，那么在PAGE电泳中，DNA-蛋白复合体比单纯的DNA迁移的慢。 DNase I足迹分析实验：倘若DNA与蛋白结合了，那么那一段DNA由于蛋白的空间位阻效应能免于被DNase I降解，从而在放射自显影图谱上，DNA梯度条带在相应于DNA结合蛋白的结合区域中断，形成一空白区域。从而知道蛋白在DNA上结合在哪一段。我们的服务没有用到同位素，而是用荧光标记DNA，最后用测序仪分析。 ChIP实验：体内检测蛋白与DNA相互结合的实验。 总而言之，EMSA和ChIP是检测蛋白与DNA是否相互结合的实验，EMSA是体外结合实验，ChIP是体内结合实验。DNase I足迹分析实验是体外分析蛋白结合在DNA上哪一段的实验。 服务内容： 样品质检：蛋白用PAGE胶电泳质检；DNA用NanoDrop质检。 探针制备：荧光引物及普通PCR引物设计；PCR扩增制备探针。 EMSA验证：重复验证客户的EMSA结果。 DNase I footprinting实验过程：a、蛋白与探针结合；b、DNase I梯度酶切；c、ABI测序仪检测。 数据处理：确定检出的蛋白保护序列并制图。 服务履行时间： 质检合格个工作日内完成结果报告送。（完成时间将根据样本数量来确定） 若有重复实验，则合同所定期限以新提交样品质检合格时间起算个工作日内。（完成时间将根据样本数量来确定）实验数据：原始数据（文件）。 实验文件：实验操作方法。 实验图像：。 用于样品要求 蛋白样品要求 样品纯度：要求蛋白样品的纯度不低于90%。一般在PAGE胶上电泳显示为一条带时，纯度即为90%。 样品浓度：浓度不低于200 ng/μl。 样品总量：总量一般不低于 10 μg（视蛋白与DNA结合力而定），建议分成多管冻存。 样品保存：要求样品分装后保存在-80℃，不能反复冻存，否则多数蛋白样品会失去活力（对温度有特殊要求的蛋白除外）。 样品运输：要求样品在未解冻情况下立即用干冰运输。客户可以联系伯豪工作人员取样。 QC检测：样品收到后未解冻；PAGE电泳检测一条带、未降解，且蛋白大小正确。 DNA样品要求 样品类型：DNA将用于PCR扩增，客户可以提供含有目的片段的质粒（经测序验证）或者基因组DNA。为了方便进一步的PCR实验，强烈建议客户提供质粒。 样品纯度：建议OD 260/280值应在1.8左右（1.7～2.0）之间；OD260/2301.5 样品浓度：10 ng/μl。 样品保存：样品保存在无DNA酶的TE或者水中。 样品运输：随蛋白样品一同运输。 QC检测：Nano Drop检测DNA浓度和纯度。 其它要求 EMSA反应缓冲液：提供EMSA结合buffer或者buffer配方，建议提供5* buffer不少于500 μl，随蛋白一同运输。 EMSA结果：提供图片及蛋白浓度梯度参数，便于足迹实验中选择合适的蛋白浓度。 DNA序列：需要提供DNA序列及EMSA反应中所用引物序列，用于足迹实验中引物设计。为了提高工作效率，建议客户提前将DNA序列和EMSA反应图片提供给本公司，以便提前安排引物设计。 其它实验，如Primer extension或者S1 mapping，请参照RNA样品准备标准。为了获得高质量的转录起始数据，请务必提供高质量的RNA。DNA样品及序列的要求，与上同。 上海伯豪生物技术有限公司 2013年01月01日 1