05_第05章-利用酵母菌生产蛋白质.ppt

（3） 真核细胞与原核细胞的蛋白质分泌途径 在原核生物中，可分泌蛋白质是由N末端信号序列控制合成的，然后通过细胞膜上的“SecY-SecD-SecE-SecF”组成的蛋白质复合物分泌出去。 在酵母菌中，分泌蛋白的信号序列为信号识别颗粒（SRF）所识别。SRF包含6种蛋白质分子，并由一个小的RNA分子将其串连在一起。通过SRF与其在膜表面上的受体之间的识别与结合，引导新生蛋白到达蛋白质的输出结构，该结构位于粗糙内质网的特异性位点上。 （4） 安全性 在原核生物中LPS的产生。LPS的毒性； 酵母菌：细胞组分和代谢物对人体是安全的。 ③ 含有一段长度为599 bp的反向重复序列。该序列将该质粒分成2部分，每一部分均含有一个启动子和该启动子控制下的2个基因，其中一个基因称为FLP，编码一个位点特异性的重组酶（recombinase）。 2 ?m质粒结构示意图 2 ?m质粒的进一步改造： ① 酵母菌-大肠杆菌穿梭质粒（YEp）：加入部分酵母菌核DNA序列和大肠杆菌的质粒复制子； ② 位点特异性重组质粒载体：将E. coli的DNA插入到重组酶识别序列的正向重复序列中，经过重组后该序列可以被丢失。 带polyA序列的磷酸甘油醛 脱氢酶终止子 磷酸甘油醛脱氢酶启动子 外源蛋白 筛选标记 （2）YRp 由大肠杆菌质粒载体pBR322改造而成：加入一段来自于酵母菌的自主复制序列，从而使YRp能在酵母菌中复制，但是具有不稳定性，容易丢失。 （3）YCp 含有酵母着丝粒序列的质粒载体，能够自主复制，稳定遗传。但是对酵母菌受体菌本身具有较大不利影响。 3.2.2 整合载体（YIp） 整合载体不含有酵母菌自主复制序列，不能在酵母菌中复制分配，但含有转座子序列或者酵母菌染色体同源序列，可使其携带的外源基因通过转座子的转座作用或者同源交换作用而整合到酵母菌的染色体上。 酵母菌基因组中含有30－40拷贝的转座子，称为Ty。Ty与反转录病毒在结构和功能上具有很多相似之处：包含由两个长的ORF和两个长末端重复序列（LTR)。 外源基因插入位点 毕赤酵母整合表达载体 AOX1p－乙醇脱氢酶启动子； AOX1t－带有polyA序列的乙醇 脱氢酶终止子； HIS4－组氨醇脱氢酶基因； oripp－毕赤酵母复制区； oriE－大肠杆菌复制区； Amp－氨苄青霉素抗性基因； 3’-AOX1－为乙醇脱氢酶基因3’ 端的一段DNA序列； 箭头处指示发生染色体整合 的位点。 3.2.3 酵母人工染色体（YAC） 为一种线状DNA载体，最初由酵母菌复制质粒 pSZ213发展而来，含有选择性标记leu2、自主复制序列和端粒序列。 现有多种商品化的酵母人工染色体，用于大片段DNA的克隆与序列分析。 酵母人工染色体克隆系统 YAC质粒（pYAC）包括以下元件： （1）Ampr (大肠杆菌抗性标记) （2）oriE（大肠杆菌复制子） （3）酵母菌DNA序列，包括：CEN，具有着丝粒功能；ARS，酵母自主复制序列，相当于酵母菌复制子；URA3，尿嘧啶生物合成基因；TRP1，色氨酸生物合成基因。 * 第5章 利用酵母菌生产蛋白质 概述 酵母菌的基因组结构及其特点 酵母表达系统 影响酵母菌中外源基因表达的调控因子 外源基因的表达及产物分泌 酵母细胞模式图 1、概述 核膜 （双层膜） 真核：DNA＋组蛋白＋RNA 核仁 细菌细胞 无核膜 、核仁 原核：DNA裸露 细胞器与膜系统差别很大 外源蛋白表达系统 原核表达系统 - 高水平表达 为还原性内环境，不能形成二硫键，某些蛋白不能进行有效折叠 1 外源蛋白表达系统 原核表达系统 - 高水平表达 为还原性内环境，不能形 成二硫键，某些蛋白不能 进行有效折叠 1 真核表达系统 相对高水平表达 可发生一定程度的翻译后修饰作 用，有利于实现完整蛋白功能 2 外源蛋白表达系统 原核表达系统 - 高水平表达 为还原性内环境，不能形 成二硫键，某些蛋白不能 进行有效折叠 1 真核表达系统 相对高水平表达 可发生一定程度的翻译后修饰作 用，有利于