菲律宾蛤仔附着变态过程中差异基因表达与基因克隆.pdf

菲律宾蛤仔附着变态过程中的差异基因表 达与基因克隆 摘要(中文) 菲律宾蛤仔(肋以tapes 布在我国黄、渤海海区，其肉味鲜美，营养丰富，为我国四大养殖贝类之一，是 捕捞和人工养殖的对象。随着人们生活水平的曰益提高，市场对该贝茁种的需求 亦日益增加。附着变态过程是贝类生活史中的关健时期，是幼虫向成体转变的重 要环节。蛤仔苗种的产量和质量在很大程度上取决于幼苗的附着变态过程，幼苗 附着变态的成功与否往往决定着出苗量和育苗的成败。因此研究其受精生物学、 胚胎发生、附着、变态等基础生物学的工作已引起科研工作者的重视，然而从分 子水平方面阐明附着变态机理的研究还不太深入。本论文以菲律宾蛤仔附着变态 时期的幼苗为实验材料，采用分子生物学技术，试图从分子水平上找出与菲律宾 蛤仔附着变态及发育相关的基因，为贝类幼苗发育生物学，生理学及分子生物学 的发展提供参考，同时为苗种业的开发提供一定的基础理论依据。主要结果如下： 1．采用DDRT—PCR技术，以受精后壳顶前期、壳顶期、眼点期、稚贝期的菲律宾 蛤仔幼虫为实验对象，研究菲律宾蛤仔幼虫不同发育时期的基因表达，进而 找出与菲律宾蛤仔附着变态相关的基因。 2．研究了肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、Y一氨基丁酸、KC]和CaCl。，在 不同剂量和不同的诱导持续时间下，对菲律宾蛤仔眼点幼虫附着变态的诱导 作用。在此基础之上，选取出最佳而又经济的神经递质类物质肾上腺素(使 用浓度为10“M，诱导时间为4h)，同样也采用DDRT—PCR技术，6组引物组合， 扩增出343条带，67条具有明显表达差异，其中的18条在对照组中有高表达， 而另外的49条差异带在实验组中有高表达，表明这些差异带所代表的基因都 和肾上腺素诱导有关，同时也从分子生物学水平上证明了肾上腺素参与了贝 类附着变态机理的调控过程。 3，以菲律宾蛤仔限点幼虫为实验材料，应用RACE技术，克隆了菲律宾蛤仔的 hiStone replacement cDNA 列L和S编码和H3．3完全相同蛋白质序列，这表明菲律宾蛤仔的H3．3 可能有多个序列编码，也可能序列L为菲律宾蛤仔的H3L一1ike序列。在这个 研究中，我们还克隆了菲律宾蛤仔的组蛋白H3基因序列，分析表明H3和H3．3 编码的蛋白质序列只有四个氨基酸的差异，表明H3和H3．3及H3L一1ike存 在着密切的关系，因此我们对它们特殊进化地位及复制依赖性的组蛋白和复 制不依赖的组蛋白进化起源进行了讨论。本研究支持histoneH3．3为H3的 祖先基因的观点，但我们认为H3L—like可能是组蛋白基因进化过程中的过渡 基因，而非祖先基因。原位杂交实验表明H3．3在外套膜及鳃的特异性部位都 有较大量的表达，后期正在进行菲律宾蛤仔不同发育时期的胚胎及其它组织 a 和器官的原位杂交实验。构建pGEX一4T—H3．3表达载体，转化原核生物DH5 受体菌后，在蛋白上清液中得到很好的表达，Westernblotting进～步证明 表达的确实是GST融合蛋白；目前抗体制备工作正在进行，为后期免疫检测 实验作好了准备。原位杂交实验及抗体制备后要进行的免疫学实验都试图证 明H3．3生物学功能及其与贝类附着变态的关系，为贝类分子生物学的发展提 供基础理论依据。 关键词：菲律宾蛤仔附着变态组蛋白H3组蛋白H3．3 The cloneinsettlement differential and geneexpressiongene and metamorphosisprocess Abstract isoneoffourmost bivalve RuE／tapesp