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第二章 组织切片技术 王永忠 第一节 取材及固定 一、动物致死法 1. 麻醉法 可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或有盖玻璃瓶内进行麻醉。也可用4%(戊巴比妥作静脉注射，剂量一般按动物体重每公斤1毫升，或用20%氨基甲酸乙酯(尿烷或乌拉坦)作腹腔注射，剂量一股按动物体重每公斤5毫升． 2. 空气栓塞法 如兔可用50毫升注射器将空气由耳静脉推入，使动物很快死亡。 3. 击头法 如大、小鼠，可用重物猛击头后部或将其头后部猛撞桌沿，最好一击而死。 4. 断头法 青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其头部，如反射尚未消失，则可用探针插入椎管中，破坏脊髓。较大动物如兔等，可用斧头迅速砍头致死。 5. 股动脉放血法 动物经吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。 无论何种致死法，都要求动作迅速，因为动物一旦死亡，其组织与细胞即开始自溶。组织学检查，特别是细胞学观察，要求材料新鲜。 二、取材注意事项 1. 材料新鲜 最好是动物的心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内．脏器的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕． 2. 组织块力求小而薄 科研使用的组织块厚度以不超过5毫米为宜，较理想的厚度为2毫米左右．不仅要考虑厚度，而且其长度与宽度，在可能范围内也应力求短小。以使固定液能迅速而均匀地渗入组织块内部。 3. 勿使组织块受挤压 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回挫动。夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损仿组织，细胞。取材时，组织块可稍取大一点，以便在固定后，将组织块的挤压或损伤部位修去。 4. 尽量保持组织的原有形态 新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。为此可将组织展平，以尽可能维持原形; 神经，肌肉组织等，则可将其两端用线扎在木片或硬纸片上固定。 5. 要熟悉取材的部位 要能准确地按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部; 脊髓取腰膨大与颈膨大处，肺应取有细支气管及带有软骨片的小支气管部位等。 6. 动物品种的选择 如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织为佳。 7. 选好组织块的切面 熟悉某些器官的组织结构，然后决定其切面的走向; 纵切或横切往往是显示组织结构明晰的关键。如一长管状器官以横切面较好。 8. 保持材料的清洁 组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。 9. 切除不需要的部分 特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉, 否则将给固定、脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。 三、组织固定法 固定是组织学制片的重要步骤。即使取材很好，若固定不当，也得不到好的切片。 1. 蒸气固定法 比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醛蒸气固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织等的固定。具体操作时，应先准备有盖培养皿一个，其中滴入1～2％锇酸水溶液2～3滴，将血液涂片放置其中。固定30秒钟至1分钟左右，立即水洗后进行染色，然后封片或其它保存处理。 2．注射、灌注固定法 某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，这时宜采用注射或灌注固定法，将固定液注入血管，经血管分枝到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。 局部灌注固定 如肺可将固定液从气管或支气管注入。肝、肾等脏器则可从肝、肾动脉注入固定液，同时，切断其静脉以便血液排出，使固定液充分进入。脑的固定，须在动物麻醉后，暴露颈动脉，此时以注射针尖向着头部的方向注入固定液，液体的出口可开在颈静脉或左心房上。有时在固定液注入之前，先注射生理盐水洗至无血色为止． 全身灌注固定 有些小动物，如大、小鼠在吸入乙醚深度麻醉情况下，可打开其胸腔，纵向切开心包膜，并用纱线在动脉弓下打一松结，然后用50毫升注射器，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，针尖刺入后，勿使其移动，随手将纱线扎紧固定，再在右心房开一孔放血。一般先用与该动物等温的生理盐水徐徐注入血管中洗涤，待流出的液体不见血色时。再将固定液注入，至固定液完全分布全身为止。 无论局部灌注固定，还是全身灌注固定，在灌注完成时，必须