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第三章细胞生物学研究方法 METHODS AND TECHNIQUES 本章内容提要 第一节 显微技术 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、显微操作技术 第二节 生物化学与分子生物学技术 第三节 细胞分离技术 第四节 细胞培养与细胞杂交 第一节 显微技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 —、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨力 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长； N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2， n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 表一、几种介质的折射率 显微镜的几个光学特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好。 sin α /2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。 （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为短波光； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 （三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 （四）暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 原理 用途：观察未经染色的玻片标本 （六）倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒； 用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。 （七）当代显微镜的发展趋势 二、电子显微镜 （一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM 1. 原理 表二、不同光线的波长 2、制样技术 1）超薄切片 用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 2）负染技术 用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 3）冰冻蚀刻 freeze-etching （二）扫描电子显微镜 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 （三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 三、显微操作技术micromanipulation technique 第二节 生物化学与分子生物学技术 一、细胞化学技术 组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。 （二）显示方法 二、免疫细胞化学 immunocytochemistry