重组大肠杆菌生产人类肿瘤基因治疗载体培养条件地研究.pdfVIP

重组大肠杆菌生产人类肿瘤基因治疗 载体培养条件的研究 徐志南 陈 濒 田 军 岑沛霖 (浙江大学生物工程研究所，杭州310027) 摘要 本文探讨了在大肠杆菌BL21系统中利用MMBL培养基生产用于疮症基因治疗的 质柱载体pCMV-AP3的有关问题。在摇瓶水平上，考察了不同的培养基组分对质杜产 贵、菌体圣和质拉DNA相对产率的影响。结果表明，菊萄糖是最适破源，当MMBL培 养基中加入5.Og/l荀萄糖时可以得到最大质拉产童 (58.3mg/I)。甘油作为辅助破源 时可以获得录大质粗DNA相对产率 ((37.9mgDNA/gDCW)。通过对不同水平的氮源和磷 酸盐的考察，得到了质拉DNA生产的最适培养基组成。进一步研究表明，尽管乙酸对 菌体生长有抑制作用，但是在MMBL培养基中加入一定f的乙酸 (4.Og/1)可以显 著提高质拉产黄。上述结果付进一步利用重组大肠杆菌系统大规模生产质拉提供了有 益的参考。 关健词 质拉DNA 培养基 墓因治疗 1 前言 生物医学产品大规模生产中所遇到的困难对生物技术工业提出了不断的挑战。FDA已经将 “医用质粒DNA载体”列人性质良好的生物技术产品清单中 (DoHHs1996),基因治疗也迅速地 从实验室阶段进人临床阶段。高效生产高纯度 (不含或尽量少含基因组DNA和RNA)质粒的要 求口益紧迫。尽管一些医药公司已经发展了很多基因治疗载体的制备及纯化方法，但是关于大 规模生产质粒的公开报道仍然较少。 当治疗用质粒DNA的载体构建和基因导人等方法设计完成之后，质粒DNA的生产研究一般 从培养基和培养条件的优化开始进行。在过去二十年中，关于利用重组细胞发酵大规模生产蛋 自质的研究已取得很大成效，建立了很多有效的宿主系统，如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌， 甚至动物细胞系统。但是，很少有通过重组大肠杆菌发酵生产质粒DNA的文献报道 (Lahijaniet a].1996)。一般认为，培养基组成对细胞生长速率有影响，并进而影响质粒拷贝数 (Kleinmanet at.1986)。因此，应综合考虑培养基组分对细胞生长和质粒产率的影响，以解决质粒拷贝数增加 与细胞生长降低之间的矛盾。乙酸积累也是培养基设计和重组大肠杆菌高密度发酵的一个主要 考虑因素，因为乙酸对细胞生长和蛋白质表达都有抑制作用 (Suneta].1993;Nakaeta1.1997)0 但是，根据我们的文献调研，目前还没有关于乙酸对质粒DNA生产的影响方面的报道。 最近，一种用于癌症基因治疗的质粒PCMV一AP3构建成功。它主要包含凋亡蛋白基因，同 时还含有真核和原核两套操纵子，可以在大肠杆菌中自我复制。本文中培养基和培养条件的优 化都是针对在重组大肠杆菌BL21系统中生产质粒PCMV一AP而进行的。 2 材料与方法 菌种与质粒 宿主菌为E.coliBL21。质粒pCMV一AP3包含一个大肠杆菌的启动子，氨节 青霉素抗性基因，凋亡蛋白基因及其真核转录单元。该质粒可表达凋亡蛋白从而特异性地杀死 肿瘤细胞。质粒的转化按标准方法进行。 培养基 基本种子培养基采用LB培养基，其组成为 (g/I):酪蛋白水解物10.0,酵母提取 43 物5.0,NaCl10.0.基本发酵培养基采用MBL培养基，其组成为 (g/I):葡萄糖5.0，酪蛋白水 解物30.0，酵母提取物5.0，甘油2.0,KH,PO43.5,玫HP045.0,(N玩),HPO,3.5,M蟒q3.5, NaCl5.0，微量元素液Mad,Amp70mg，其中微量元素组成为 (叨):FeC13.6H,00.162, ZnCl,.4H,00.0144,CoCl,.6H,00.12,Na,MoO4.2H,00.012,CaCl,.2H,00.006,CuSO,.5H,0 L.9,H3BO,0.5，HCI(37%,w/v),37m1/1。采用Plackett一Burman实验方法确定了影响质粒产率 的主要因素。 摇瓶培养 种子培养和发酵培养均采用250m1的三角烧瓶，装液量均为30m1/瓶。培养温度: 3690，摇床转速:200rpm。在无菌条件下，从新制备的平板上挑取单菌落于摇瓶