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从特定的细胞中分离与核糖体结合的mRNA 核酸的分离与纯化技术是生物化学和分子生物学中的一项基本技术。其中，RNA，尤其是mRNA的制备与分析，在了解基因表达方面是分子生物学的研究的关键步骤。 大部分真核mRNA分子的3’端存在一个20～30个多聚腺苷酸残基poly（A），可以用磁珠法或者寡聚（dT）的纤维素亲和而纯化。 磁珠法 一 摘要 基因表达谱技术可以分析来自器官，组织和细胞的转录产物。然而，由于器官和组织是由各种类型的细胞组成，且有各自的基因表达模式，因此这些方法受到了限制。 为了鉴定复杂组织中某一细胞类型的转录组，研究人员用物理方法，原位杂交或者免疫组织化学的方法分离不同类型的细胞，但都有一定的局限性。 本文我们描述一种快速有效地分离体内任何细胞类型中与核糖体结合的mRNA转录组的方法。 我们建立了一个小鼠系---RiboTag（Tag Ribosomes） ，带有一个Rpl22等位基因，该基因C端的一个野生型外显子4的左右各有一个Lox P位点，其后还有一个带有3个血凝素（HA）抗原决定簇拷贝的外显子4。 在特定细胞类型中，多聚核糖体与单克隆抗体（抗原为HA）的免疫沉淀反应就能够分离与核糖体结合的mRNA转录组。 二 简介 利用转基因技术使抗原决定簇标签表达或利用绿色荧光蛋白（GFP）等报告基因克服了在分析复杂组织中特定细胞类型的转录组中遇到的困难，因此研究者可以鉴定感兴趣的细胞。 用人工解剖，荧光激活细胞分类术（FACS）或者激光捕获显微切割技术（LCM）可以从复杂的器官中分离这些标记的细胞。 mRNA转录组可以通过免疫沉淀反应从多聚核糖体中分离出来，然后用定量的RT-PCR或微阵列等标准基因识别技术分析。 三 实验材料和方法 RiboTag小鼠 表达Cre 重组酶小鼠 pBluescript KS+质粒 HA序列 各种限制性内切酶 胚胎干细胞 HA抗体和c-myc抗体 四 实验过程及结果 用于表位附加的核糖体蛋白质的选择和靶载体的设计 核糖体由大约80个蛋白质组成。当检测用绿色荧光蛋白（GFP）标记的大型酵母和哺乳动物蛋白质的C末端时，在适当的细胞区室发现了4个核糖体蛋白质亚基（RPS17，RPS25，RPL22和RPL36）。 我们选择标记Rpl22基因，该基因是从细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC ）中分离得来的，为9.8kb。这个靶基因包含2个外显子4，第一个为野生型外显子4，左右两边各有一个loxP位点，第二个外显子4被HA标记。 细菌人工染色体（BAC） 用于 DNA片段克隆的载体系统一直是分子生物学中不可或缺的重要工具。 质粒系统容量小(15 kb)，只适用于一般基因的克隆，很少用于DNA文库(DNA library)的构建，尤其是真核生物的文库构建。 粘粒容量虽有所增大(45 kb)，但对于一些较大的基因簇(gene cluster)的研究仍然无能为力。 酵母人工染色体(yeast artificialchromosom, YAC)系统容量很大(可至数Mb)，已被广泛应用于DNA文库的构建和基因簇研究，但其易于发生重组，缺乏稳定性及制备工艺的繁琐局限了它的使用。 20世纪90年代发展起来的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC) 是一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。 它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点。在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用。 补充2 定位重组系统 目前，选择标记基因被广泛应用于细胞的遗传转化，用于区分转化和非转化细胞，但当筛选完成后，选择标记基因不再有用，将之从转基因细胞中去除有以下几个优点： 定位重组系统是由单个多肽酶识别特定的DNA序列而发生重组的遗传操作系统。 每种重组系统都主要由两部分组成：重组酶和特异性识别位点。 Cre/LoxP重组系统 Cre重组酶 (cause recombination)：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，由343个氨基酸组成，它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DNA序列，如：LoxP位点，引起重组。 Cre/LoxP系统条件性敲除基因 在胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)中通过置换型载体进行同源重组，向靶基因位点两侧引入两个同向排列的Lox P位点。将该ES细胞打人假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”。 FLP/FRT重组系统 来自于啤酒酵母细胞核内2μm质粒