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人类遗传病实验讲义 实验 真核细胞DNA的制备与定量 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究以及基因诊断的重要步骤，通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温冻存的组织细胞中提取，以前常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的，现在已开发出专门用于提取基因组DNA的试剂盒。通过这一方法获得的DNA不仅酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解：（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 实验试剂及仪器 DNA提取试剂盒（BBI），内含TE水，细胞裂解液，沉淀液，1.2M的NaCl，蛋白酶K，RNase A 预冷的无水乙醇，70%乙醇，氯仿 超声波细胞粉碎仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅 实验步骤 1．取100mg小鼠脾脏组织，加入200μl的TE，用超声波细胞粉碎仪充分匀浆。 2．加入400μl的细胞裂解液，充分混匀，再加入6μl的蛋白酶K，55℃孵育10分钟，中间偶尔混匀。 3．加入600μl的氯仿，轻柔混匀，高速离心（﹥10000rpm）2分钟，此时样品应该分为三相，而基因组DNA在最上面一相中。如果未能分成以上各相，那就是样品与氯仿之间未能混合均匀。 4．将500μl上清移入一新的1.5ml离心管中，加入500μl的沉淀液，混合均匀，室温放置2分钟，高速离心2分钟。 5．弃上清，将沉淀重溶于100μl 1.2mol/l的NaCl中，轻弹，直至沉淀完全溶解，再加入3μl的RNase A，37℃孵育10分钟。 6．加入300μl预冷的无水乙醇，混匀，并在-20℃放置10分钟。高速离心5分钟，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀，离心弃上清，空气中干燥10分钟。 7．将沉淀溶于100μl的TE中，37℃孵育2小时。 DNA定量和电泳检测 DNA定量 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1㎝光径，用H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（㎎/ml）=50*OD260读数*稀释倍数/1000。 DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。 电泳检测： 取1μg基因组DNA用行0.8﹪琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。 注意事项： 1．所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。 2．所有试剂均用高压灭菌双蒸水配置。 3．用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。 4．用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。 作业与思考 1．如何防止DNA的降解？ 2．蛋白酶K和RNase A的作用是什么？ 3．如果DNA降解成小片段，电泳时会出现什么样的电泳图象？PCR技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。 PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延