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细胞永生化 杨 星 什么是细胞永生化？ 细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过程。 正常细胞的增殖能力有限,经过一定时间的增殖后, 最终会进入一种生长抑制状态, 而一些肿瘤细胞可以无限增殖。 Hay flick界限 Hay flick界限：体外培养的细胞，不是不死的，而是有一定寿命的，其增殖不是无限的，而是有一定界限，这个界限称为Hay flick界限。 在体外培养的人正常细胞, 经一段时间的分裂, 就会进入一种生长抑制状态, 即衰老期( M1期)。大多数真核生物细胞(生殖细胞、 干细胞除外)都具有这种特性。 经转化了的细胞可越过衰老期而进入另一增殖抑制状态,即危机期( M2期) ,危机期的细胞开始出现退化, 并逐渐死亡。 只有少数细胞在一定因素的影响下, 端粒酶被激活, 以自身RNA 为模板合成端粒DNA 来补充或延长端粒,恢复染色体的稳定性,从而使细胞越过危机期,发生了永生化。 细胞永生化意义 了解细胞增殖与衰老的分子机制及保存一些重要疑难病例的样本。 为治疗肿瘤、 控制肿瘤细胞的增殖以及器官移植的研究奠定了坚实的基础。 由于永生化细胞具有可以多次传代的这一特性, 我们可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、 增殖慢、 易衰老的细胞获得永生,从而为我们提供更多的细胞资源。 　细胞永生化的分子机制 目前认为,细胞永生化的模式如下:细胞经多次分裂后 ,在肿瘤抑制因子 ,如p53、Rb 等作用下,细胞进人衰老期(M1)期,此时细胞对生长因子等失去反应 ,产生 DNA合成蛋白抑制因子 ,细胞周期检查点发送细胞周期停止信号,DNA合成停止,细胞开始衰老 ,但不一定死亡。而病毒、原癌基因、抑癌基因突变体则可以抑制M1期机制,细胞绕过 M1期继续生长。细胞经过 20-30PDs后,进人危机期(M2期),细胞出现退化,分裂细胞逐渐减少 ,绝大多数细胞发生凋亡 ,只有罕见的细胞在一些因素影响下 ,可越过M2期获得永生性转化。 　促使细胞永生的基本方法 一、病毒转染 EB 病毒 EB 病毒( epstein-barr virus) 在体外能使 B 淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系, 它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。 目前, EB 病毒感染细胞使其永生应用最多的是B 淋巴细胞,可以直接用与EB 病毒共培养的方法,而在其他细胞中的应用很少。 SV40 病毒 　SV40 是简单的真核细胞病毒, SV40 的T抗原片段是最常用的目的片段, 将其整合入靶细胞核内并表达,可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。 近年, 人们已成功获得多种 SV40转化的永生细胞株,应用的方法包括:野生型SV 40病毒共培养感染靶细胞、 磷酸钙法、 电穿孔以及逆转录病毒载体法等。 其它病毒 　一些病毒如乳头瘤病毒E6、 乙型肝炎病毒( HBV) 虽不是使细胞永生的常用病毒,但它们可以使一些特殊细胞的增殖能力加强。人乳头瘤病毒E6 蛋白是最常见的转化蛋白,通过对端粒酶催化亚基( hT ERT )的转录调控而激活端粒酶。 二、端粒酶 　端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合体,为一种特殊的DNA 聚合酶,合成DNA到染色体末端,因而被认为是一种依赖自身RNA 的逆转录酶。在体外培养的正常体细胞中, 端粒长度逐渐缩短,细胞克隆将面临增殖危机和死亡, 但这种细胞的端粒酶一旦被激活, 将维持端粒缩短和延长的动态平衡,从而使细胞获得无限增殖的能力, 使之永生或癌变。病毒转化的各种人永生化细胞试验结果证明端粒酶活化可能是细胞永生化的共同步骤,病毒的转化能使一些细胞(如成纤维细胞、 胚肾细胞等) 越过M1 阻断, 但并不能使细胞顺利的度过M2 期。在许多转化细胞和肿瘤细胞中端粒长度近于临界值, 所以推测端粒酶活化可能是细胞永生化过程中较晚的事件。 研究细胞永生化最常用的方法就是通过构建含端粒酶催化亚基( hT ERT ) 的表达载体, 通过各种方法来转染细胞。 三、放射因素 　通过X 射线、 电离辐射、 60Co等放射性因素进行细胞永生化的方法, 可使细胞周期得到延伸。可能是由于放射因素破坏了细胞的衰老机制,或促进了与细胞永生相关基因的表达。 四、　癌基因、 原癌基因 　根据细胞凋亡与增殖的机理,有人用c-myc、 c-fos、 Ras 等原癌基因转染细胞,使抑癌基因突变功能丧失, 从而使细胞永生。 转染c-myc基因到人正常乳腺上皮细胞, 可恢复端粒酶活性,并使p53 发生突变,进而促进细胞永生化。但也有一些癌基因不仅不能转化细胞, 甚至促进细胞的衰老,如Ras 癌基因、 Ab5 等。 EB 病毒转化人类外周血B-淋巴细胞建立永生细胞系 　EB 病毒 (epst