POD_测定方法.docVIP

植物体POD的测定 ※原理 了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性。 过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。 实验材料、试剂与仪器设备 1、实验仪器　722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵 2、实验试剂　愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］ 3、实验材料　任何植物材料 实验步骤 1、粗酶液的提取　称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO4 5mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液。 2、酶活性的测定　取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。以每分钟表示酶活性大小，即以OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。 结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.g(鲜重)]表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示。 过氧化物酶活性[u/(g.min)]= 式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。 W——植物鲜重，g。 VT ——提取酶液总体积，mL。Vs ——测定时取用酶液体积 ,mL。 t——反应时间，min。 项目详细信息介绍 项目名称 过氧化物酶(POD)活性的测定（比色法） 所属实验课程 植物生理学实验 学年度 2007-2008 学期 01 专业分类 生物化学 关键词 过氧化物酶(POD)活性的测定 实验要求 选修 带课教师 陈颖 实验目的 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光度计测量生成物的含量。 基本描述 1．称取植物材料1g，加入，0.1mo1/L磷酸缓冲 (pH7.0) 10ml(分三次加入，最后两次用于洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆，以 4 000r／min 离心15分钟，倾出上清液。 2．取一试管加 3.8 ml 0.3%愈创木酚反应液，加100ul 3％过氧化氢，加酶液100ul （视酶活性大小而定，如酶浓度高可稀释后再测定），摇匀，立即在分光光度计470nm下测吸光度，从加入酶液时立即开启秒表记录时间，1分钟时读数一次（也可2min，视材料而定）。 3．以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min.mg蛋白质（或鲜重g）表示之。过氧化物酶活性(U)=A470/min×稀释倍数/g.Fw 该实验涉及到的主要仪器设备 null 实验总人数 30 每组人数 4 实验学时 2 是否特色 否 实验地点 植物生理学实验室 过氧化物酶(POD)活性的测定 【实验原理】 植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H202的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除H202的重要保护酶，能将H202分解为02和H20,从而使机体免受H202的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。 (CAT)催化如下反应： 2 H202→2 H20+ 02 本实验通过测定H202的减少量来测定CAT的活性。 在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。 【试剂药品 1.50m mol/l pH7.0的磷酸缓冲液 2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸缓冲液至 50ml 3.0.2% 愈创木酚 :秤0.2g愈创木酚加入pH7.0的磷酸缓冲液至 100ml 【实验步骤】 酶液的制备 1.称取叶片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min 离心15min取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。 2. CAT活性的测定 在3ml的反应体系中，包括0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液 启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度。