扫描电镜的研究硝酸纤维素膜上的共结晶.pdfVIP

电子显徽学报 J．chin．EIectr．M1crosc．soc 19(3)l373～3742000年 373 扫描电镜研究硝酸纤维素膜上的共结晶 魏开华张德添杨松成 汪保珍张学敏 (军事医学科学院田家生特医学分析中心，北京l00850) MALDI．ToF—MS以其“高灵敏度、宽分子量范围、允许混合样和一定量盐”的特点而溅为蛋 白质分子量测定的重要手段。但由于一些变性剂和无机盐常与样品竞争结晶，不但会大大抑制样 品信号，而且会产生一些难以解折的离子峰。因此，测试前应尽可能除去样品中的添加剂。而将 蛋白质吸附或印迹到转移膜上是除去干扰物的重要方法之一[1]。固定在金属靶上进行MALDl— ToF—Ms分析的转移膜01，应满足以下要求：能吸附蛋白质和肽；在操作样品过程中样品不丢 失；干燥后的膜上蛋白质应能很好地重新溶剂化；蛋白质和基质均应在膜表面结晶。而蛋白质和 氟乙烯膜(PVDF)和聚乙烯膜(PE)上结晶。硝酸纤维素膜具有较高吸附量、可再溶剂化、低价格 等特点，本文用它作为蛋白质和基质的支持物，通过扫描电镜来观察膜上结晶情况，探讨了膜的 表面性能与共结晶的关系，这在国内尚不多见报道。 材科与方法 液。取3～5“l甲醇或乙睛将膜充分润湿，稍干后加1～3pl蛋白质溶液，自然干燥后，将靶在去离 子水中浸泡5～10s以洗去水溶性盐等杂质。再加2pl溶剂将蛋白质重新溶剂化，并及时加人1pl 基质溶液，充分干燥。必要时，重复溶剂化以获取好的结晶。 2．扫描电麓 在样品上喷金后，选择20kV高压，及在不同放大倍数下，用PhiIipssEM一505扫 插电镜进行表面形态观察。 结果与讨论 共结晶效果是MALDI—ToF—MS的关键。“包裹型”(样品包裹基质或基质包裹样品)共结晶 最适合于MALDI测试。就细胞色素c而言，容易形成较大的晶体，基质则形成鞍小的晶体。因 此，共结晶时出现几种类型：“包裹型”，基质被包裹在蛋白质晶体中(图1)；。包围型”，基质晶体 环绕在样品晶体周围(图2)；“孤立型”，基质晶体基本上与样品晶体分开(图3)。 膜表面的物理、化学性能对蛋白质膜上结晶影响很大。尼龙、PVDF和NC三种转移膜，究竟 谁好谁差，至今仍无定论。有人认为，聚乙烯膜比直接用金属靶还好“1。最初的分析是将10pmoI P(一种改性PVDF)膜上，再滴加氰基肉桂酸基质饱和溶液，可观察到 蛋白质漓加在Immobilon 基质的离子峰，但只观测到扳弱的样品信号。而且有太的“洞穴(cavern)”口j。而NC膜的孔径分 布只有o．2～1．5“m，样品更容易吸附在NC膜的浅表面，而不是深深的渗进去。从结合容量和吸 附力的角度来说，PVDF优于NC和尼龙，适合于蛋白质电印迹后的膜上序列分析．但不一定适 用于MALlDI—TOF+MS，因为强吸附可能导致蛋白质难以重新溶剂化和与基质共结晶。因此，合 适的结合容量、吸附力、孔径分布和孔深是非常重要的。 值得讨论的是，润湿前后膜上孔的形态有明显变化。润湿前，不仅孔小，而且稀疏；润湿后，孔 百…’一囊砸 电子显徽学报J．ChiⅡHectr．Microsc．soc 374 19(3)，373～37l2000年 大而密。这有利于蛋白质的吸附和再溶剂化。至于采用甲醇还是乙腈来润湿膜，有不同的看法。 有人认为应采用甲醇，强调不宜用乙腈”。而我们实验认为，除了所用的聚偏氟乙烯膜外，其它膜 可受此限制；对于NC膜，两种溶剂均可。而且，乙腈是MALDI—TOF—MS中最常用的溶剂，因 而，本文用乙腈充分润湿NC膜后再滴加样品溶液，获得了较好的图谱效果。 ●考文献 Dw．Acade删c [1]specicher Pres8，INc．1989．24． T，et 3 [2]wats∞J Am．S0c．Ma$s a1．J Spectrom．．1994．5230． a1．AnaI l K，et [3]strupat chem．，1994，66464．