高效毛细管电泳在人类金属硫蛋白研究中应用.pdfVIP

CE．007 高效毛细管电泳在人类金属硫蛋白研究中的应用 王莹 张影如梁秀龄陈嵘 (中山医科大学附属第一医院神经科广州510080) 1前言 高效毛细管电泳(HPcE)是近年发展起来的一种新型的生物分析及分离技术”12l。由于 其具有快速、高效和样品用量少等优点，在生物化学等研究领域得到广泛的应用。我们应 定，探讨该技术在人类金属硫蛋白研究中的应用。 2实验部分 2．1 主要实验仪器及试剂 型，瑞典)，原子吸收分光光度计(Ⅶian，S口ec订AA-4．OP型，澳大利亚)，毛细管电泳仪 (Beckm∞，P『AcE sci％6fjc IY-4-SM—sF-QD syst∞．5500型，美国)；冷冻干燥机(snigderS 型，美国)。磷酸盐缓冲液(pH G-25，Phmacja公司)，二乙基氨基乙基纤维 交联葡聚糖凝胶(SephadexG．75，sephadex 素(DEAESephadexAl25，Pbamacia公司)．Tris(Gibco公司)。 2．2分离方法”” (1)新生儿肝细胞胞浆的分离：取刚死亡的新生儿肝脏。用D．H锄ks液反复冲洗后剪 8．6，含o．25mol，L 成小块，吸千水分后称重。加入2倍体积的0．05mol几Tris—Hcl液(pH 蔗糖)。在冰浴下胄4成组织匀浆。在4℃和108kgf条件下离心60min，取上清液，测定铜、 锌、蛋白质含量． G-75 8．6)平衡的sephadex (2)MT的制备：将样本上在预先用0．05mol几Tris-Hcl液(pH 凝胶柱(2．6mm×90锄)上，上样量为100mg，次，以同样的缓冲液在4℃下洗脱，流速 30mL，Il。检测波长214nm。共收集96管，每管2．5mL．测定铜、锌的含量． 8．6)平衡的DEAE A．25纤维素柱(2．6mm×30cm)上进行离子交换层析。 液(pH s印hadex 8．6；B液： 以Tris．HcI缓冲液在4℃下进行直线梯度洗脱(A液：O．01mol，LTris-Hcl，pH 0．30mol几Tris．Hcl，口H 测定铜、锌的含量．分别收集含MT．I和Mrr-II的组分，冷冻干燥浓缩成体积约15mL， G一25柱(2．6mm×40啪)上在4℃ 再分别在预先用o．olmol，L碳酸氢胺平衡好的sephadex 下进行脱盐。所得的MT．I和MT-II冷冻干燥后称重，于-20℃下封存。 Tris— (4)HPcE分析人、兔M，r亚组分：称取一定量的MT亚组分千粉．用O．Olnml，L Hcl缓冲液(pH i．d．)， 液。在高效毛细管电泳仪上选择下列条件进行分析：未涂层毛细管(57cm×50um o．05mol，L磷酸盐缓冲液(pH7．O)，分离电压20kV，并制标准曲线。同样配制兔肝MT溶 -804- 液(1．Og，L)进行HPcE分析。 3结果 单一(图2)，两个亚组分绘制的标准曲线线性关系良好(图3，4)。 图1人-卜I的HPcE分析图谱 o