荷人脑胶质瘤裸鼠瘤体内酪氨酸酶基因表达的磁共振成像初步的研究.pdfVIP

荷人脑胶质瘤裸鼠瘤体内酪氨酸酶基因表达的 磁共振成像初步研究 苏州大学附属第一医院影像中心(215006) 胡春洪罗加林曹建平周献峰郑斯英陈剑华邢建明丁乙 基因及基因表达成像属分子影像学范畴，是当今医学影像学、分子生物学、分子遗传学、 基因治疗学等多学科研究的前沿和热点，被认为是二十一世纪医学影像学三大发展趋势之一。 未来分子影像学的研究成果将对疾病的诊断和治疗产生重大而深远的影响。分子影像学研究 有望更早期发现异常改变，甚至在“疾病前驱期”即能够作出诊断，如实施干预就可免除病 患。 编码酪氨酸酶的酪氨酸酶基因(tyr基因)为研究基因表达成像的热点候选基因之一。 理由有二：第一，tyr基因满足基因表达成像的基本前提条件；第二，黑色素具有独特的结 构和性质，其功能多样。酪氨酸酶是黑色素生物合成过程的关键酶，编码酪氨酸酶的tyr基 因成为研究黑色素性状和白化病的必备工具。目前，借助MRI监测酪氨酸酶基因表达还局限 于体外研究。本文在离体细胞实验研究的基础上，用pcDNA3．o—tyr转染人脑星形细胞瘤细胞 株SHG44，接种至裸鼠皮下制成荷瘤模型，开展基因表达的体内MR成像的初步研究。 材料与方法 一、材料 kb的酪氨酸酶全长cDNA 1．质粒pCDNA3．o—tyr由5．4kb的真核表达载体pcDNA3．0和1．8 片段组成，具有EcoRI和XbaI酶切位点，由美国哈佛分子影像中心Simonova博士提供。 2．细胞株人脑星形胶质细胞瘤细胞株SHG44由苏州大学附属一院脑神经研究室建株并 提供，常规培养于10％FCS—RPMIl640培养液内。 F： 3．RT—PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，Tyrosinase 5’一GTGCTCTGGCAACTTCAT一3’；TyrosinaseR：5’一TACTCCTCCAATCGGCTA一3’oPCR扩增产物 片段大小：576bp。 4．主要试剂质粒抽提试剂盒购自Viogene公司和QIAGEN公司；限制性内切酶购自 BioLabs公司、Takara、MBI Ladder、100bpDNALadder购自 Ferments、Promega公司；ikb Reverse GeneRuler公司；AMV 公司；硫酸铁购自上海生化试剂厂。 5．主要仪器设备细胞CO。培养箱(Heraeus公司)；PE9600型PCR扩增仪(PE公司)；隔 (i00071／20071／2071／2．5 5415D台式微型离心机、 71)、EppendorfCentrifuge 6．实验动物取5～6周龄的无特定病原体(SPF)级BALB—C裸小鼠10只，雌雄不限， 随机分为实验组(6只)和对照组(4只)o 二、方法： 1．质粒酶切鉴定：质粒经扩增和纯化后，分别取179的pcDNA3．o—tyr质粒和179的 u u EcoRI和4XbaI酶，并加入乙酰化牛血清 pcDNA3．0空载体于Eppendorf管中，各加4 蛋白(BSA)及酶切缓冲液，加入去离子水使其成20?l反应体系，将反应管置于37。C水浴 温育3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段大小。 2．质粒转染SHG44细胞：胶质瘤细胞株SHG44在25m1培养瓶贴壁生长至70％一80％，0．25％ 胰酶消化后，800 rpm离心，细胞悬浮于200mOsm／L电击缓冲液中(细胞浓度1×106／m1)； 准备2瓶80071细胞悬液(约含106个细胞)，分别加人10?gDcDNA3．o—tyr载体及pcDNA3．0