水牛AQP8基因克隆与其表达分析.pdfVIP

水-爿：AQP8基因克隆及其表达分析 李胜，屈春风，李润，何金娜，石德顺，李湘萍 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西大学，广西，南宁530004 摘要：水通道蛋白广泛参与动物生殖细胞发生与发育等许多重要过程。为了进一步研究水通道蛋白在水牛 卵泡发育过程中的功能作用，本研究对水牛AQP8基因进行了克隆，构建了其真核表达载体，对AQP8基因 在水牛睾丸及卵巢组织中的表达进行了研究。结果发现水牛AQP8基因编码区长度为732bp，与黄牛及人 AQP8基因的同源性为100％。AQP8蛋白在水牛不同发育阶段卵泡及睾丸中均有表达，在次级卵泡中的表达 显著高于原始和初级卵泡。研究结果为下一步研究AQP8基因在水牛卵泡颗粒细胞凋亡过程中的功能奠定 了基础。 引言 已发现与雄性和雌性生殖系统发育相关的AQPs有11种，它们参与了哺乳动物生殖细胞发生过程中的很多重 要环节，如卵泡发育、囊胚形成、胚胎着床、羊水量的调节等。本研究对水牛AQP8基因进行了克隆，构建 了其真核表达载体，对AQP8基因在水牛睾丸及卵巢组织中的表达进行了研究。研究结果为深入阐明 AQP8基因在水牛卵泡颗粒细胞凋亡过程中的功能奠定基础。 材料与方法 水牛材料来自广西南宁市鲁班路屠宰场，采取新鲜的水牛睾丸及卵巢组织。Trizol法提取水牛睾丸及 进行PCR反应，扩增产物与pMD．18T载体连接、转化、质粒鉴定及测序。AQP8基因克隆扩增引物： Forward5’．CTCGAGATGTTTACAGAGGCAGCTGT．3’：Reverse5’ ．TTAGA．3’。测序结果用BLAST程序进行同源序列比对；进化树构建采用MEGA5．0软件进行。将水牛 AQP8基因编码区插．入至IJpEGFP．N1载体中，真核表达载体构建，通过酶切鉴定和细胞转染实验，验证构建的 载体有效性。石蜡切片结合DAB染色免疫组化。 结果 1水牛AQP8基因克隆及其序列分析 克隆得到水牛AQP8基因编码区序列长度为732bp，推测可编码244个氨基酸。同源比对分析发现，水 牛AQP8基因核苷酸序列与牛、猪、鼠、人的同源性分别为100％、99％、100％、99％；氨基酸序列的同源 性为100％、86％、99％、100％。进化树分析发现水牛AQP8基因与黄牛的亲缘关系最近。蛋白质功能分析 体结构域同源序列。将构建的水牛AQP8真核表达载体经脂质体转染293T细胞后，荧光显微镜观察可见清 晰的绿色荧光蛋白表达。 2AQP8基因在水牛睾丸及卵巢组织中的表达 免疫组化结果发现，在水牛原始和初级卵泡中，AQP8蛋白主要表达定位于卵泡细胞和膜间质细胞， 在次级卵泡主要定位于颗粒细胞中。平均光密度值定量分析发现， AQP8基因在水牛卵泡不同发育阶段表达有显著差异，在次级卵泡 中的表达显著高于原始和初级卵泡，后两者表达差异不显著。 AQP8基因在水牛睾丸组织中也有表达。 图1AQP8基因在水牛睾丸及卵巢组织表达的免疫组化结果 A、B：水牛睾丸组织及阴性对照； C、D、E、F：水牛卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡及阴性对照 结论 水牛睾丸及卵巢组织中均有表达。 重点项目 41