抗氧化测定方法(三种).docVIP

实验一 超氧阴离子自由基清除的超氧阴离子自由基清除超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。 邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣?，02﹣?能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣?的浓度，清除02﹣?就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。邻苯三酚三羟甲基氨基甲烷(Tris)pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml。 0.2mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制 ）（一）样品的测定 （1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比色管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入25℃水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制 ），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。每管做三个重复，取平均值。. （2）同上述过程，只是用1mL的蒸馏水代替样品液，测定结果为原始管（A原）。每管做三个重复，取平均值。 02﹣?清除率（%）= × 100% A样参比：缓冲溶液4ml+1ml样液+1mlHCl（0.05mol/L）代替邻苯三酚溶液A原参比：缓冲溶液4ml+1ml水代替样+1mlHCl（0.05mol/L） （二）阳性对照试验 将抗坏血酸等抗氧化药品配制成梯度浓度，与提取样品一起进行抗氧化实验，进行结果对比，以判断样品的抗氧化能力。方法同样品的测定，只是将样品用抗氧剂代替即可。 实验二 羟自由基清除能力的测定 ——抗氧化实验之二 方法一：羟自由基（·OH）清除能力的测定——邻二氮菲-Fe2+ 氧化法 一、目的要求 熟悉羟自由基清除能力测定的原理，掌握操作方法。 二、实验原理 羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，可以发生电子转移、夺取氢原子和羟基化等反应，可以使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类都发生氧化，并损伤膜结构及功能，在研究自由基时，反应可通过水的辐射、光解及化学反应来产生羟自由基，Fenton反应是最常见的化学反应，Fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法。 邻二氮菲-Fe2+是一种氧化还原指示剂，其呈色变化可反映出溶液中氧化还原状态的改变。H2O2/Fe2+体系，通过Fenton反应所产生的羟自由基（HO·），邻二氮菲-Fe2+水溶液可被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+，从而使邻二氮菲-Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失，根据吸光度的变化，可推知系统中HO·的产量。 Fenton反应是以过氧化氢为氧化剂，以亚铁盐为催化体系的氧化反应方法，其反应机理如下： Fe2+ +H2O2→Fe3+ +OH–+?OH 羟自由基可以与抗氧化剂发生作用，由于邻二氮菲–Fe2+水溶液显橙红色根据邻二氮菲–Fe2+颜色的变化可利用分光光度法（536nm处特征吸收峰的变化）对抗氧化剂的抗自由基性能进行分析。 三、器材与试剂 （一）器材 恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。试管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。 （二）试剂 邻二氮菲、H2O2、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、抗坏血酸、BHT、乙醇等。 （1）0.75mmol/L邻二氮菲溶液：取邻二氮菲（邻菲啰啉）1.487g，溶于100.00ml无水乙醇中，使用时用重蒸水稀释100倍。 （2）·清除率（d）： d%=［（A样－A损伤）/（A未损伤－A损伤 ）］×100% 总的HO·的产生量： △A536=A未损伤－A损伤 加入样品后HO·的产生量： △A536=A未损伤－A样 实验三 还原力试验 实验原理[10]：还原能力的测定是以样品是否是良好的电子供应者为指标的。如果样品是良好的电子供体，其供应的