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实验十一 亲和层析纯化胰蛋白酶 一、引言 前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。 另外 ，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。 亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。 二、实验目的与要求 1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法； 2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术； 3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。 三、基本原理 简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。 许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。如：酶 和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。特异性的抗体一抗 原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。 在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（ Ligand ），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（Matrix, 如Sepharose 4B）制成亲和吸附剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。其过程可用简图表示如下： 亲和层析原理示意图 本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在pH = 7~8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH =2~3时，又能被解离下来。 因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直接获得活力大于10,000 BAEE单位/ 毫克蛋白 胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到10 ~ 20 倍以上。 四、试剂与器材 主要试剂：丙酮 三氯乙酸 HCl NaOH NaCl NaHCO3 Na2CO3 氯代环氧丙烷 乙腈 甲酸 Tris CaCl2 KCl DEAE-纤维素 Sepharose-4B. 新鲜猪胰脏 鸡蛋清 乙酸 二氧六环 二甲基亚砜 主要贮存溶液： 1. 鸡卵粘蛋白层析液（1升）0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer。 2. DEAE-纤维素处理液：0.5 mol/L HCl 300ml 和0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.3升。 3. 卵粘蛋白洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer 含0.3mol/L NaCl, 150ml. 4