猪肺炎支原体黏附因子P97R1、膜蛋白P46单抗制备.pdfVIP

猪的传染病一其他 3．2本研究基于猪肺炎支原体特异性P36基冈建立套式PCR方法，该方法能够特异性检测猪肺 炎支原体，扩增出427bp的特异性片段，而其它种类的支原体(鸡毒支原体、猪絮状支原体、猪鼻支 原体)、细菌(猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌2型)以及病毒(猪流感病毒、 猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒)的扩增结果均为阴性，表明该方法具有 良好的特异性。 3．3 贾丽艳18】等建立的兽用疫苗中检测猪肺炎支原体的套式PCR方法，最低可检测到 低大约能检测出5．50个猪肺炎支原体；本研究建立的套式PCR方法对猪肺炎支原体检测的敏感性和 特异性有了进一步提高，最低可以检测出大约10个猪肺炎支原体。本研究设计的测定套式PcR敏感 性方法是基于实际操作，已经将提取PcR模板过程中的损耗计算在内，因此本方法更具有实际意义， 更具有良好的临床应用价值¨小川。 3．4本研究用建立的套式PCR方法成功地对经肺内免疫猪肺炎支原体(168株)活疫苗后支气管 肺泡灌洗液中疫苗株进行检测，表明该方法不仅可以用于猪肺炎支原体的临床诊断，而且也可用于 监测疫苗免疫效果。本研究只选择了肺脏灌洗液作为检测样品，但我们正在研究将该方法运用于对 肺组织或鼻拭子等其它样品的检测，以提高本方法的检测范围和可行性。 ◆考文献(略) 猪肺炎支原体黏附因子P97R1、膜蛋白P46单抗制备4 冯志新刘茂军王海燕甘源 吴叙苏邵国青 (江苏省农业科学院兽医研究所．农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室-国家兽用生物制品工程技术研究中心．江 苏省生物兽药筛选服务中心，江苏南京210014) 摘要目的P46蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白，且与其它支原体无交叉反应，常作为猪肺炎支原体检 测的靶蛋白或靶基因。P97蛋白是猪肺炎支原体的黏附因子，与病原的感染与致病机制相关，其中R1区是P97蛋白 的主要抗原决定簇。制备针对该两种蛋白的特异性单抗能为猪肺炎支原体的检测及机理研究提供有效的资源。方法 本研究用猪肺炎支原体全菌抗原免疫小鼠，分别利用大肠杆菌表达的P46蛋白和P97Rl蛋白作为筛选抗原制备P46 白及猪肺炎支原体全菌蛋白中46KD大小的蛋白发生特异性反应．但配对试验表明，该两株P46单抗是针对同一表 原体全菌蛋白中80．120KD之间的两蛋白发生特异性反应。本研究制备的五株杂交瘤细胞株经三个月冻存或连续传代 三个月均能保持较高的滴度。蛄论本研究分别成功制备了两株针对猪肺炎支原体P46蛋白以及三株针对P97Rl蛋白 的特异、稳定且高滴度的单克隆抗体。 关冀词猪肺炎支原体；p46蛋白；P97R1蛋白；单克隆抗体 泛，发病率高，死亡率不高，但由于Mhp能破坏呼吸道黏膜一纤毛屏障，从而继发其它致病菌的感染， 提高致死率。此病在世界范围内广泛存在，造成巨大的经济损失。Mhp与呼吸道黏膜纤毛的特异性 吸附是引起MPS的先决条件。Min砌等【l】研究表明，97蛋白Rl区直接参与支原体与呼吸道纤毛的黏 附，同时P97的主要抗原决定簇也位于该区域。P97R1区在猪肺炎支原体的检测诊断与致病机理研究 方面具有重要意义。另外，由于猪肺炎支原体与其它的猪源支原体，如猪鼻支原体、絮状支原体和 自主创新资金项目(cx(08)608) 通讯作者：邵国青，(E．mail163．comTel．025 第十三次学术研讨会会议论文集 猪滑液支原体等存在很高的抗原交叉性，给猪肺炎支原体的病原学与血清学检测造成一定的困难。 对猪肺炎支原体各结构与功能蛋白研究表明，P46蛋白为Mhp的表面抗原，是引起早期免疫反应的表 面脂蛋白，也是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白，且与其它支原体无交叉反应睇J。因此，P46蛋白 可以作为建立MPS抗原抗体诊断方法的优选抗原。本研究以纯化的猪肺炎支原体全菌蛋白作为免疫 P46和P97R1融合蛋白作为筛选抗原制备猪肺炎支原体P46蛋白和 原，分别以大肠杆菌表达的Mhp P97Rl蛋白的特异性单抗，为下一步的诊断检测及致病机制研究提供基础。 1材料与方法 1．1猪肺炎支原体全菌抗原的准备 7．6)洗涤3次，菌体重悬于5ml无菌PBS 于12000印m离心30min，收