万古霉素糖基转移酶GtfE在雷莫拉宁产生菌中的异源表达和鉴定.pdfVIP

  万古霉素糖基转移酶 GtfE 在雷莫拉宁产生菌中的异源表达与鉴定 王元希， 林惠敏，陈俊升，邵雷，李继安，陈代杰* ( 中国医药工业研究总院 上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室 上海 200040) 摘要：雷莫拉宁(Ramoplanin)属于糖肽类抗生素，能够抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素 肠球菌，并且因为其具有独特的化学结构、强大的抗广谱革兰氏阳性菌的功效和暂无对其耐药的报道， 而越来越受到人们的关注，目前已经进入Ⅲ期临床研究。万古霉素糖基转移酶GtfE在万古霉素生物合 成途径中负责催化活性葡萄糖连接至万古霉素苷元，已有文献报道其具有良好的底物宽泛性，能够识 别非天然糖受体与非天然糖供体，获得糖基多样性的化合物。本研究将万古霉素糖基转移酶GtfE在无 糖雷莫拉宁产生菌中进行体内表达，通过体内转糖反应，以期获得雷莫拉宁。本研究从万古霉素产生 菌Amycolatopsis orientalis HCCB10007 中PCR扩增万古霉素糖基转移酶基因片段，同时用Kpn I和Xba I 双酶切pSP72质粒，用Sac I和Xba I双酶切得到扩增的gtfE基因片段。然后酶切，对酶切回收后得到的三 个片段进行连接，得到带有红霉素启动子的pSP72质粒，命名为pWYX12-3-31 。 从pWYX12-3-31 中用 EcoR I和Xba I双酶切， 同时用EcoR I和Xba I双酶切pSET152质粒。再次酶切，对酶切回收后得到的两 个个片段进行连接，得到带有红霉素启动子与gtfE 片段的pSET152质粒，命名为pWYX12-4-12 ，基因测 序结果与标准序列完全一致，电泳检测质粒构建成功。用pWYX12-4-12转化E.coli ET12567 的感受态细 胞得到转化菌株。此时含有质粒pWYX12-4-12 的E.coli ET12567菌株作为供体菌株，与无糖雷莫拉宁产 生菌(Actinoplanes CJS1001)进行接合转移，得到阳性接合子。获得突变株mWYX-dRE, 我们首先验证 其基因型正确，接着在其RNA转录水平进一步验证，电泳结果均显示正确，确定了GtfE基因在无糖雷 莫拉宁产生菌中的成功表达，然后进行突变株发酵培养。经HPLC检测处理过的发酵液，发现突变株 mWYX-dRE有新的化合物产生，我们命名为RW,对突变株mWYX-dRE发酵产物进行分离纯化后，得到 液相纯度达到95% 以上的RW样品进行初步结构鉴定，经LC-MS检测中发现信号m/z ([M+2H]2+)=1278， 计算MASS为2554 ，同时LC-MS检测无糖雷莫拉宁产生菌发酵产物中不存在这一新的化合物，以上结 果表明，万古霉素糖基转移酶GtfE能够在无糖雷莫拉宁产生菌中进行异源表达，并生成了新的化合物 RW ，因在液相条件下检测结果与A2 的一致，且经过LC-MS检测分子量相同，我们推测可能是雷莫拉 宁A2或者是其类似物，我们的工作为今后深入研究新的化合物的生成提供了新的思路。 关键词： 雷莫拉宁，万古霉素，糖基转移酶，异源表达 雷莫拉宁（Ramoplanin ）是由意大利的Bruno 等在游动放线菌Actinoplanes sp. ATCC 33076 发 酵液中分离得到的具有抗菌活性物质 A/16686[1]，有 A1 、A2 、A3 三个成分，其中 A2 为主成分占 80% 以上，A2 的分子量为 2554 。1989 年，三个组分的结构被阐明[2] 。雷莫拉宁由 17 个非天然氨基 酸残基组成的肽链骨架，在骨架 11 位羟基苯甘氨酸(Hpg11)上连有 2 个 D 型甘露糖。万古霉素糖基 转移酶（GtfE ）在万古霉素生物合成途径中负责催化活性葡萄糖连接至万古霉素苷元，已有文献报 道其具有良好的底物宽泛性，能够识别非天然糖受体与非天然糖供体。我课题组已在前期工作中， 构建了糖基转移酶基因失活的无糖雷莫拉宁产生菌株Actinoplanes CJS1001 。在本文工作中，我们尝 试在 Actinoplanes CJS1001 中表达GtfE 基因，以了解该酶对于无糖雷莫拉宁骨架的活性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒 * 通讯作者：陈代杰 Tel: 021 －703 , E